多溴聯苯醚-47對淡水背角無齒蚌熱休克蛋白基因表達的影響

王 涵，張 珊，薛士鵬，宋國英，于瑞雪，劉慶春，王中曉，張慶遠，劉 麗，李冰潔，夏西超,

(1.南陽醫學高等專科學校基礎醫學部，河南南陽 473061；2.平頂山學院醫學院，河南平頂山476000)

熱休克蛋白(HSP)是一個超基因家族，在調節機體應激反應和耐受性方面發揮重要作用[1,2]。在正常和應激條件下，HSP幫助蛋白質折疊、膜轉位、錯誤折疊蛋白質降解等方面具有積極作用[3,4]。根據其分子量不同，HSP可以分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP20等5個家族。HSP60是最為保守且研究相對廣泛的家族之一，當生物細胞或個體受到物理、 化學、重金屬、有機污染物、病原物等因素脅迫時，HSP60 參與熱激反應中的蛋白質合成、線粒體DNA代謝、細胞內多肽折疊、受損線粒體蛋白運輸等重要生理過程，以自發減少機體損傷[5,6]。多溴聯苯醚(PBDE)是常見淡水持久性有機污染物，具有持久性和高生物蓄積的特點，已經引起學者的極大關注[7]。PBDE-47是水體中最豐富的有機污染物，其生物毒性顯著強于其他溴化化合物[8]。前期研究表明，PBDE-47處理可能導致淡水背角無齒蚌(Anodontawoodiana)機體應激反應和急性毒性效應，具體機制有待進一步探究[8]。在本研究中，從背角無齒蚌中克隆出AwHSP60完整基因序列，通過real-time PCR分析AwHSP60表達，為揭示PBDE-47毒性效應奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 背角無齒蚌處理

實驗用背角無齒蚌購自南陽市水產市場(殼長6.5±0.5 cm)，實驗室自動水循環系統中養殖2周。PBDE-47購自Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，溶解于二甲亞砜(DMSO)中以制備儲備液。動物處理實驗在長方形塑料盒(40 cm×25 cm；10 cm 高)中進行，飼養采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[8]。將來自同一塑料盒5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織，并迅速放入液氮保存，用于RNA提取。用同樣的方法，將80只河蚌隨機飼養于10個塑料盒中，8只/盒，分為對照組和PBDE-47處理組，每組5個盒子。PBDE-47 處理組采用3.36 μg/L的PBDE-47進行處理，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。第0、1、3、6、9、12 和 15 d從每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

總RNA提取采用TRIzol試劑(寶生物生物有限公司，大連)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，具有完整mRNA條帶的RNA用于合成cDNA，M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應模板[8]。

1.3 背角無齒蚌AwHSP60核心片段的擴增

簡并引物AwHSP61和AwHSP62分離AwHSP60 cDNA保守區域片段，反應條件：94℃ 4 min，1cycle;94℃ 40s，48℃ 40s，72℃ 50s，32cycles；72℃ 10min，1cycle。PCR產物連接至pMDT-19載體，雙向測序、NBCI比對確定為HSP60核心片段。確定HSP60部分cDNA序列后，根據部分cDNA序列設計的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，5′Race Outerprimer和AwHSP60-5-1進行第一次擴增，以反應產物為模板，反應條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 50s，20 cycles；72℃ 10min，1cycle。5′Race Innerprimer和AwHSP60-5-2進行第二次擴增，反應條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min，1cycle。3′Race Outerprimer和AwHSP60-3-1進行第一次擴增，以反應產物為模板，反應條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 50s，20cycles；72℃ 10min，1cycle。3′Race Innerprimer和AwHSP60-3-2進行第二次擴增，反應條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min，1cycle。擴增AwHSP60 cDNA5′和3′區域序列進行雙向測序，5′RACE和3′RACE的PCR產物用DNAMAN軟件進行拼接。

1.4 序列和系統發育分析

分析AwHSP60序列，通過GenBank 數據庫搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行BLAST程序比對；根據http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 預測信號肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白質結構域；使用DANMEN分析程序對AwHSP60基因進行多序列比對；通過Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)預測；AwHSP60的蛋白質三維結構；使用MEGA5.0軟件構建系統進化樹。

表1 PCR擴增引物序列Tab.1 PCR amplified primer sequences

1.5 AwHSP60 mRNA水平定量檢測

為了確定AwHSP60轉錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進行定量分析。β-actin作為內參基因，根據AwHSP60-F和AwHSP60-R引物常用PCR儀中分離靶基因(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測出一個條帶，PCR產物測序，序列鑒別。使用ABI7500實時檢測系統(Applied Biosystems，美國)進行real-time PCR，20 μL體系中包括：SYRB Premix ExTaqTM(TaKaRa)10 μL，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye(TaKaRa)0.4μL，dH2O 6.8μL。反應條件：95℃ 30s， 1cycle;95℃ 5s，60℃ 34s， 40cycles，通過2-△△CT分析AwHSP60表達水平。

1.6 統計學分析

采用SPSS10.0統計軟件，AwHSP60 基因表達水平以±s表示，假設檢驗采用單因素方差分析(ANOVA)，組間多重比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 背角無齒蚌AwHSP60基因cDNA序列和預測蛋白質序列分析

AwHSP60 cDNA序列由1 940 bp核苷酸序列組成，包含一個69 bp的5′-端非編碼區、167 bp的3′-端非編碼區和一個1 704 bp的開放閱讀框。開放閱讀框由一個568個氨基酸組成的多肽，分子量為61.03 kDa，等電點為5.91(圖1)。終止信號(AATAAA)位于3′-端非編碼區的2 000-2 005位點位置(圖1)。AwHSP60氨基酸序列包線粒體定位靶序列(1-MYRLPSILRPVLTRHLAPCLSRAY-24)、HSP60 家族標簽序列(428-AAVEEGIVPGGG-439)、三個ATP/ADP 結合位點(52-TMGPKG-57，74-DG VTVAKGI-8，193-RDGVITVKDGKTLHDELEV-210)、Mg2+結合位點(107-AGDGTTAATVL-117)，3′末端典型GGM重復基序和負責從中間結構域到頂部轉位區(213-EGMKFDRGYISPYFINTQKG-232)等HSP60家族多個保守結構域(圖 1)。

2.2 背角無齒蚌AwHSP60 的進化關系

BLAST結果表明，AwHSP60氨基酸序列與其他HSP60家族成員親緣關系較近，AwHSP60氨基酸序列與淡水三角帆蚌、光滑雙臍螺和加州海兔同源性分別為97.71%、80.21%和76.95%。此外，AwHSP60氨基酸序列與模式生物之間也存在高度同源性，與人、小鼠、斑馬魚和果蠅同源性分別為75.74%、76.27%、73.91%和71.18%。從脊椎動物和無脊椎物種選擇不同 HSP60家族成員，通過MEGA5.0鄰接法構建系統發育樹，分析AwHSP60的進化關系。AwHSP60進化上與雙殼類和腹足綱動物親緣關系最近，魚類和哺乳動物次之，甲殼動物較遠，細菌親緣關系最遠(圖2)。

圖1 背角無齒蚌AwHSP60基因的cDNA序列和推導的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequences of A.woodiana AwHSP60 gene and deduced amino acid sequences□:HSP60基因標簽序列，—：ATP/ADP 結合位點，：線粒體定位序列，……:Mg2+ 結合位點，*:終止密碼子，：poly A信號序列

2.3 背角無齒蚌AwHSP60組織分布

Real-timePCR結果顯示，AwHSP60廣泛表達于背角無齒蚌的斧足、鰓、心臟、肝胰臟、血淋巴、閉殼肌和外套膜(圖3)。AwHSP60 mRNA在肝胰臟和鰓中表達水平最高，血淋巴、外套膜和心臟表達水平次之，斧足和閉殼肌中表達水平最低(圖 3)。

2.4 PBDE-47 對背角無齒蚌AwHSP60 表達的影響

正常情況下，AwHSP60在動物肝胰臟、鰓和血淋巴穩定表達，PBDE-47處理組后 AwHSP60表達受到顯著影響。在第1 d至15 d，PBDE-47處理后肝胰臟中AwHSP60 mRNA水平隨時間顯著上調(圖4)；與對照組相比，AwHSP60 mRNA水平在第1d增加了89.9%；第15天，AwHSP60 mRNA水平增加了6.73倍(圖4)。與對照組相比，PBDE-47處理后鰓中AwHSP60 mRNA水平在第1天至15天增加了2.09 倍(P<0.01)(圖 5)。與對照組相比，PBDE-47處理后血淋巴中 AwHSP60 mRNA水平增加了2.13倍(P<0.05)(圖 6)。

圖2 根據背角無齒蚌AwHSP60氨基酸序列使用鄰接法構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by adjacency method which according to the A.woodiana AwHSP60 amino acid sequences

圖3 背角無齒蚌AwHSP60基因的空間表達Fig.3 The spatial expression of A.woodiana AwHSP60 gene每組數據來源于3只動物，重復3次

3 討論

背角無齒蚌屬于淡水底棲生物，以水體的懸浮物質為食物進行濾食生活，是水體污染重要評價生物之一。本研究中，通過分析背角無齒蚌肝胰臟、鰓和血細胞中AwHSP60基因的轉錄水平，探討暴露PBDE-47毒性作用機制 。

圖4 PBDE-47對背角無齒蚌肝胰腺AwHSP60基因表達的影響Fig.4 The effection of PBDE-47 on A.woodiana hepatopancreas AwHSP60 gene expressionn=5；“*”“**”表示與相應對照組相比有顯著或極顯著差異(P<0.05，P<0.01),圖5,6同

AwHSP60 有一個連續性開放閱讀框，包括ATP結合結構域、轉換區域和保守結構域。對于多數基因而言，蛋白序列通常與無脊椎動物、植物和細菌存在較高的相似性[9,10]。AwHSP60蛋白序列與軟體動物、脊椎動物、甲殼動物和昆蟲具有高度同源性，其蛋白質不穩定指數為29.23(<40)，提示AwHSP60具有高度穩定性，并排除來自原核生物的可能性。AwHSP60中有一個高度保守的線粒體靶定位序列，提示AwHSP60可能是一個線粒體分子伴侶[11,12]。在 C 末端區域，AwHSP60有一個GGM重復序列，該結構能夠提供疏水作用表面，在促進折疊中間體重排過程中發揮積極作用[13,14]。基于AwHSP60與 HSP60家族成員之間存在高度保守相似性，AwHSP60可能在應激環境條件下新生蛋白質折疊過程中發揮作用。序列比對和系統進化分析結果表明，從軟體動物到昆蟲，到脊椎動物，HSP60結構和進化譜系高度保守。背角無齒蚌和三角帆蚌HSP60基因存在更為親近進化關系，提示這兩個物種來自同一祖先。AwHSP60進化上與雙殼類和腹足綱動物親緣關系最近，魚類和哺乳動物次之，甲殼動物較遠，細菌親緣關系最遠，提示雙殼類和腹足綱動物從無脊椎動物分離出來后形成了一個新的分支。背角無齒蚌AwHSP60 mRNA水平具有廣泛的分布模式，這種分布模式與AwHSP60參與的環境適應性和耐受性相關。肝胰臟是軟體動物主要消化、吸收和分泌器官，對環境變化特別敏感[15]。鰓是環境中污染物進入機體主要入口，并能與其直接接觸[16]。雙殼類循環系統是一個血液和淋巴液混合在一起的開放式循環系統，血淋巴在淋巴管、血竇和全身軟組織中流通。黏膜組織的血淋巴填盈充足，這些器官與周圍環境進行氧氣的交換或營養素提取有關。血淋巴是應對環境應激一個重要防線[16]。肝胰臟、鰓和血細胞在維護動物穩態方面發揮關鍵作用，也是環境因素作用的靶點[16]。由此可見，肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP60高表達與背角無齒蚌應對環境的耐受性密切相關。

圖5 PBDE-47對背角無齒蚌腮AwHSP60基因表達的影響Fig.5 The effect of PBDE-47 on A.woodiana gill AwHSP60 gene expression

圖6 PBDE-47對背角無齒蚌血淋巴AwHSP60基因表達的影響Fig.6 The effect of PBDE-47 on A.woodiana hemolymph AwHSP60 gene expression

在本研究中，PBDE-47處理可顯著誘導肝胰臟、鰓和血淋巴中 AwHSP60表達水平，提示背角無齒蚌能夠通過上調AwHSP60表達提高對PBDE-47暴露的耐受能力。背角無齒蚌作為濾食性淡水生物，靠過濾水體中營養物質來維持生存。PBDE具有較高的親脂性，水中溶解PBDE很容易蓄積在細胞和組織中，導致活性氧(ROS)大量產生和機體氧化應激。正常情況下，ROS會很快被一系列抗氧化酶清除，維持在一個合理水平。氧化應激條件下，過量生成ROS可引起DNA損傷、脂質過氧化和蛋白質糖基化，造成蛋白質錯誤折疊幾率增加。HSP表達上調有助于錯誤折疊蛋白質進行修復、蛋白質膜轉位、錯誤折疊蛋白質降解，提高環境適應性。相關文獻報道，水體柴油污染后能夠導致巴西牡蠣的鰓和消化腺中HSP60表達水平顯著上調，水體殘留的抗抑郁藥物氟西汀能夠誘導河蜆消化腺中HSP60和HSP70 mRNA水平上調[17]。干擾蛋白質正確折疊是環境污染物影響機體功能重要路徑之一，激活HSP表達是動物恢復正常生理功能和提高適應性的關鍵策略。低等生物缺乏后天免疫系統，軟體動物上調HSP60表達應對溫度、病原物、重金屬和污染物的影響具有重要意義[17]。AwHSP60表達上調是背角無齒蚌應對 PBDE-47引起氧化應激的重要手段之一。

肝胰臟中 AwHSP60 mRNA水平的上調表現出時間依賴性模式，提示這可能與動物機體代償機制有關。動物長期暴露PBDE-47環境中，機體通過適應性機制處理應激效應，并逐漸恢復細胞穩態。作為一種細胞內分子伴侶，HSP60參與細胞內外免疫調控并保護細胞免受環境應激損害，HSP60常表現出一種時間依賴性表達方式[18,19]。整個實驗觀察過程中，背角無齒蚌鰓中AwHSP60表達呈倒U型曲線，早期上調，中期達到峰值，后期下降，提示這種現象可能與動物對持續產生氧化應激的耐受能力有關。隨著PBDE-47處理時間延長，PBDE-47在體內不斷蓄積，將不斷產生ROS，導致細胞承受逐漸增加的氧化應激效應，機體通過上調HSP 表達減少錯誤折疊蛋白質產生，增強耐受性[20]。一旦PBDE-47產生氧化應激水平達到峰值并超出細胞耐受能力，巨大應激效應將導致細胞損傷、炎癥反應和細胞凋亡[21,22]。這種情況下，如果動物缺乏產生新細胞去補償死亡細胞的能力，活細胞數量將逐漸降低[23,24]。值得注意是，肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP60表達呈現不同的時空特征，提示該表達模式可能組織功能相關。軟體動物肝胰臟具有肝臟和胰腺的雙重功能，參與消化和中和大量毒素[15]。鰓與外部環境直接接觸，作為環境污染物主要入口[16]。蚌類淋巴細胞是抵御病原體入侵的重要屏障[16]。

本研究從背角無齒蚌克隆出AwHSP60全基因序列，該基因包含HSP60家族高度保守的標簽序列。PBDE-47處理可顯著上調肝胰臟、鰓和血淋巴中 AwHSP60 表達水平，其原因與增強動物對氧化應激的耐受能力有關。