血管內皮祖細胞鑒定及其促血管新生機制的研究進展

潘天岳，劉 浩，符偉國，董智慧

復旦大學附屬中山醫院血管外科，上海 200032

母體懷孕3周內，卵黃囊和母體循環系統通過彌散的方式為胚胎提供營養和氧氣。3周后，中胚層的血島結構開始形成原始脈管系統[1]。血島中央為造血干細胞群，周圍少量細胞為血管母細胞或更早期的干細胞群，兩者可能有共同的前體，即血液母細胞。通常認為，血島周圍的內皮母細胞轉化為內皮祖細胞后最終分化為內皮細胞(endothelial cells, ECs)，組建毛細血管網，在所處的內環境作用下塑形為動脈、靜脈和毛細血管系統。

出生后，血管新生的主要參與者為機體局部原有的ECs。ECs在一定誘因(如組織損傷、缺氧、缺血、炎癥)作用下發生增殖和遷移，形成新的微血管結構[2]。1997年，Asahara等[3]從人外周血中分離出表達CD34的單個核細胞，其在體外培養后可增殖并傳代，同時CD31、TIE-2等內皮特異性標志物增加，形態與ECs相似；在小鼠缺血模型上進行尾靜脈注射后，該細胞群定植于肌纖維間的新生微血管周圍，其中部分參與微血管的形成。該研究團隊將該細胞群稱為 “EC progenitors”，為從成人體內分離和鑒定內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的最早研究成果。

1 EPCs的鑒定方法

1.1 纖維連接蛋白(FN)培養分離 使用包被FN的培養板接種外周血單個核細胞，48 h后去除不貼壁的細胞，貼壁細胞中能吞噬低密度脂蛋白并與植物凝集素結合者可鑒定為EPCs。這種方法簡單易行、成本低，但是存在細胞群混雜，其中大多數細胞為外周血單核-巨噬細胞[4]的缺點。而外周血單核-巨噬細胞既表達低密度脂蛋白受體和清道夫受體，也能吞噬低密度脂蛋白。因此，這種方法分離的EPCs純度較低，不利于在后續實驗中精確地分析EPCs的功能。

1.2 熒光激活或免疫磁珠分選 使用熒光激活分選系統(FACS)或免疫磁珠分選法分離EPCs。其原理為使用偶聯熒光素或磁珠的單克隆抗體，將其與表達相關抗原的細胞結合，再通過分選系統識別被標記的細胞并從外周血中分離出來[5]。因此，這種方法的準確性依賴于對抗體的選擇。其中，最經典的抗體組合是由Peichev等[5]及Timmermans等[6]提出的CD34+CD133+VEGRF2+，該組合引起了廣泛關注。然而，Case等[7]指出，通過這個組合分離出的細胞群最終形成表達特異性抗原CD45的造血干細胞群落，而非EPCs群落。Duda等[8]提出了CD34+CD31+CD45-CD133+組合，并通過流式細胞術在外周血單個核細胞中分離出了該細胞群落，其占單個核細胞總數的0.01%～0.20%。總之，通過抗體介導的分選方法簡單、快速，分選結果在不同個體的標本中具有較高的一致性。但是，目前研究者們仍未找到EPCs特異性的表面抗體，使該分選方法精確性降低。

1.3 內皮集落形成細胞(endothelial colony forming cells，ECFCs)鑒定法 該方法由Yodar等提出，相較于前2種方法，該方法更側重于ECs功能學檢測[9-10]。具體方法為從外周血、骨髓或臍帶血中分離單個核細胞后，將其接種于包被了FN的培養皿上，用含5%～10%胎牛血清的促血管內皮生長培養基(如EGM-2)培養24～48 h后，去除未貼壁細胞，貼壁細胞繼續生長，14～21 d內出現的典型“鋪路石”樣細胞集落即ECFCs。

ECFCs除具有已知的全部EPCs特性外，還表達ECs的標志性表面抗原，且不表達任何白細胞和髓系標志物[11]。ECFCs具有較強的增殖能力，在體外成小管實驗中能形成內皮樣管樣結構，且在動物模型中參與微血管的形成[12-13]。因此，ECFCs常被認為是EPCs家族中的主要成員，甚至能代表EPCs。另有研究[14]將ECFCs稱為晚期內皮祖細胞(LEPCs)或OECs(outgrowth endothelial cells)。最近一項研究[15]顯示，在ECFCs群落中，可分離出CD34+和CD34-細胞。大部分CD34+ECFCs有較強的自我更新能力，以及高水平的Notch信號通路蛋白，使細胞周期處于G0/G1期；而CD34-ECFCs大多處于S/G2M期，更接近于分化成熟的ECs，自我更新能力和集落形成能力弱，但增殖能力強[11]。這提示可以從基因及細胞周期水平鑒定EPCs。

2 EPCs的來源

自從1997年Asahara等提出出生后EPCs的概念后，有關成人體內EPCs的來源一直存在爭議。目前，一般認為外周血EPCs可能同時來源于骨髓造血系干細胞和外周或骨髓組織的的非造血系干細胞[16]。

來源于骨髓造血系的EPCs與造血干細胞可能有相同的前體細胞，如血液母細胞。這些細胞表達與造血干細胞相同的抗原CD34、CD133等。在使用ECFCs法培養48 h后分離出的不貼壁細胞繼續生長5～7 d可形成集落形成單位(colony-forming units, CFU)，這些細胞被稱為CFU-ECs，或早期EPCs。這些細胞表達CD14、CD45等髓系細胞表面抗原，形態呈紡錘樣或多邊形，能夠分泌大量的促血管新生細胞因子，但很少融合入ECs形成的血管網[12]。此外，有研究[17-18]發現有些造血系來源的EPCs并不形成CFU，但有潛力在體外或體內形成血管樣結構。一些研究[19-20]甚至發現，來自髓系的單核-巨噬系統的干細胞或祖細胞可在特定微環境下形成血管內皮。目前已報道的來自骨髓造血系的EPCs種類豐富，這些EPCs可能均由髓系干細胞分化而成。

非造血系來源的EPCs不表達或極少表達CD14和CD45，且經體外培養后，其形態和功能學與造血系來源的EPCs也不同。Yodar等[21]分離出的ECFCs是非造血系來源的EPCs，而可能直接來源于外周器官的血管壁。Fang等[22]發現，這些存在于血管壁的EPCs表達CD117。Schniedermann等[23]從小鼠肺組織微血管分離ECFCs，發現其具有較強的形成血管和淋巴管的潛能。Rapp等[24]從胎盤上分離出ECFCs，其不表達CD34和CD45表面抗原，并且顯示出比臍血ECFCs更強的血管生成能力。

上述研究表明，CFU-ECs和其他大量表達CD14或CD45的EPCs來源于骨髓造血系干細胞，而ECFCs來源于外周器官的血管壁和骨髓非造血系干細胞。

3 EPCs參與出生后血管新生的機制

Asahara等[3]發現，靜脈注射的外周血CD34+單個核細胞可以在小鼠缺血肢體中直接融合入新生微血管管壁，有些直接形成微血管；而CD34-單個核細胞聚集在肌纖維周圍，不參與微血管形成。Schatteman等[25]在糖尿病免疫缺陷小鼠的肢體缺血模型中，經肌肉注射植入人CD34+細胞，結果發現缺血肢體血流灌注加速恢復。上述研究提示部分EPCs通過融合入新生微血管壁來促進其生成，增加血流灌注。這些直接參與新生血管形成的EPCs的來源一直是研究重點[25]。HU等[26]將BALB/c小鼠的動脈移植入C57BL/6/TIE2-LacZ小鼠后，觀察到宿主骨髓來源的表達β-Gal+的細胞參與供體血管壁的內皮增生。有研究[27-28]在下肢缺血和心肌缺血造成的損傷組織中也觀察到骨髓來源的EPCs直接參與血管新生。Perry等[29]用來自C57BL/6J小鼠的骨髓細胞移植入eNOS-/-小鼠，4周后僅在血液中和血管周圍發現供體細胞，而未在血管內皮中發現供體細胞嵌合，提示骨髓EPCs不直接參與正常衰老的ECs自我更新。而Aicher等[30]在異種共生態模型和Lacz+供體/Lacz-受體模型中發現，供體動物非骨髓來源的EPCs直接參與受體動物肢體缺血后的血管內皮再生，比例高于骨髓來源的EPCs。由此可見，骨髓和非骨髓來源的EPCs都能直接參與組織損傷后新生血管內皮的形成，而非骨髓來源的EPCs可能直接參與衰老血管內皮的更新。

除直接參與血管內皮形成外，EPCs旁分泌細胞因子也可促進血管新生。Urbich等[31]用基因微陣列技術對比了人外周血EPCs、臍靜脈ECs和微血管ECs的促血管新生相關基因的表達情況，發現血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)、VEGF-B、基質細胞衍生因子 1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)和類胰島素生長因子(insulin-like growth factor-1, IGF-1)的mRNA在EPCs中的表達量明顯高于ECs；在EPCs培養液中，這些細胞因子含量也較高。Miyamoto等[32]從骨髓中分離出高表達VEGF-A、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的細胞亞群，說明這些起旁分泌作用的EPCs部分來源于骨髓。研究[33-34]在動物缺血模型中發現，植入的EPCs停留于微血管壁外，周圍有大量VEGF，提示EPCs在損傷組織內通過旁分泌細胞因子促進血管新生。Sahoo等[35]發現，人外周血CD34+細胞能分泌促血管新生的外泌體；體外和體內實驗顯示，新生血管形成與外泌體含量呈劑量依賴關系。外泌體中除包含生長因子和促血管新生因子外，還包含微小RNAs(miRNAs)。研究[36]證實，miRNAs可以通過表觀遺傳學方式調控EPCs的旁分泌作用，促進血管新生?？傊?，部分EPCs可能通過旁分泌生長因子、細胞因子和外泌體誘導周圍ECs遷移和增殖，促進新生血管形成；EPCs可能來源于骨髓造血系統。EPCs參與新生血管形成的機制見圖1。

近期，Yodar等[37-38]將上述2種機制進行了統一：造血系來源的EPCs首先歸巢至缺血或損傷的組織，然后通過旁分泌促血管新生因子招募血液中及周圍組織中的ECFCs至損傷處，直接介入血管內皮形成，并進一步通過分泌細胞因子促進已有ECs增殖和自我更新?；谶@種理論，組織損傷的修復能力可能取決于局部ECFCs的含量。腎臟微血管ECs增殖能力較弱，表現為急性腎損傷后組織內血管新生極少，而有的器官ECs體外培養時則表現出較強的增殖能力[39]，可能提示不同器官內ECFCs數量差別較大。

如前所述，造血系來源的EPCs需要歸巢至損傷組織才能進一步發揮作用。而在歸巢前，這些細胞須經歷動員、遷移、黏附等步驟。Dawei等[40]總結了這些過程所涉及的細胞及相關分子機制：組織損傷后向血液中釋放VEGF、SDF-1等細胞因子，通過SDF-1/CXCR4軸或eNOS/NO/MMP-9/kitL軸使骨髓造血系EPCs與骨髓間質細胞脫離，并向外周血遷移；EPCs順SDF-1濃度梯度向損傷組織處遷移，通過整聯素和P選擇素黏附和定植于損傷的血管內皮，進一步通過旁分泌作用促進血管生成。阿卡波糖、維生素D等藥物可通過直接或間接增強以上途徑來增強EPCs的促血管新生作用[41]。總之，骨髓來源的EPCs是修復組織損傷的先驅，為ECFCs和其他EPCs提供了增殖和分化的有利環境，且同時促進原有ECs的遷移和增殖。

圖1 血管內皮祖細胞分化過程及促進出生后血管新生機制

4 總結與展望

EPCs的發現填補了出生后血管新生領域的空白。隨后，其來源、作用和促進血管新生的機制逐漸獲得深入研究。大量動物缺血和組織損傷模型驗證了EPCs修復組織和血管再生的能力，為臨床上基于EPCs的治療性血管新生提供了理論依據。由于近年來發現單純的EPCs移植常達不到預期的治療目標，在此基礎上加強EPCs的促血管新生作用的方法逐漸被探討，如在移植前缺氧預處理EPCs[42]或采用微應力刺激促進EPCs增殖[43]。隨著EPCs研究的不斷深入，相信EPCs在臨床上將得到更廣泛的應用。