禽流感高敏熒光免疫分析快檢試劑盒的研制與應用

王澤洲，吳俊清，章健，吳冠英，陳弟詩，賀冬梅

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

由于H7N9亞型禽流感對人具有傳染性和致死率，可能對公共衛生安全和社會穩定造成較大的危害和影響，因此對該病的早期診斷、監測非常重要。本研究應用鑭系元素作熒光標記物，研制了一種既簡單方便、快捷，又準確、特異、敏感的禽流感高敏熒光免疫分析快速檢測試劑盒（LFICA）。現將初步研究結果報告如下:

1 材料和方法

1.1 材料禽流感（AI）通用型單抗，禽流感H7亞型單抗，羊抗兔IgG抗體、兔IgG抗體，H9、H7、H5、H3亞型禽流感抗原，新城疫（ND）抗原和雞傳染性支氣管炎（IB）抗原等，雞泄殖腔和咽喉拭子樣品由相關合作單位提供。吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺，切條機、點膜與噴金膜機，鑭系熒光納米微球和熒光儀，其他試劑均為國產分析純。制備包被膜、抗體標記微球、雙抗體夾心法建立等，均參照說明書或按照相關要求操作。

1.2 熒光免疫分析試紙條的組裝在濕度小于30%，溫度20～25℃的環境下，把吸水紙、標記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條（圖1），將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡，裝入鋁箔袋封存備用。

圖1 鑭系熒光免疫層析法結構示意圖

1.3 標準曲線以標準陽性抗原和陰性樣本建立標準曲線。相關陽性抗原和陰性樣本由本單位提供。

1.4 特異性試驗選取H9、H7、H5、H3亞型禽流感抗原、新城疫抗原等陽性樣品，稀釋40倍，應用禽流感高敏熒光免疫分析試紙條檢測，同時設空白和陰性對照，以確定該方法是否發生交叉反應。

1.5 敏感性試驗將H9、H7、H5、H3標準陽性抗原進行1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1:10 240倍比稀釋，每個稀釋度平行做4個重復，分別用建立的通用型和H7亞型AI-LFICA試劑盒檢測，判斷抗原檢出滴度。

1.6 重復性試驗在相同條件下，選取8份AIV抗原含量不同的樣本，每份樣本平行做10個重復，分別用組裝的通用型和H7亞型AI-LFICA試劑盒檢測（批號為20180613），同時對檢測結果進行統計學分析。

1.7 比較試驗用同一份樣本同時進行HA、Bionote試紙條、熒光RT-PCR和AI-LFICA檢測，并對結果作比較，計算AI-LFICA相對于其他試劑盒的符合率、敏感性和特異性。

1.8 試劑盒的組裝及保存期試驗AI-LFICA試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4℃保存（37℃），于保存后不同時間，按照AI-LFICA各個優化條件，對AIV陽性和陰性參考樣品進行檢測，并對結果進行統計學分析。

1.9 試劑盒應用試驗取100份雞咽喉拭子樣品，用通用型AI-LFICA試劑盒和RT-PCR同時檢測，比較結果。

2 結果

2.1 測定條件選擇

2.1.1 標記量的選擇把標記好的質量比（抗體/微球）不同的熒光微球稀釋相同倍數，組裝成檢測卡，在檢測卡加樣孔中分別加入80μL參考樣本，室溫下層析15 min，檢測，考察并驗證不同標記量對標記結果的影響。結果表明，隨標記抗體濃度的增加，各濃度點的結合率呈現先增后降的趨勢，當抗體/微球的質量比為1∶25時曲線有拐點，以后漸平。因此，選擇標記比例為1∶25的免疫微球進行后續實驗。

2.1.2 加樣量的選擇在其他條件一致的情況下，考察并驗證樣本不同加樣量對檢測結果的影響。在檢測卡加樣孔里分別加入50、60、70、80、90、100、110μL參考樣本，室溫下反應15 min后檢測。結果表明，隨加樣量的增加，各濃度點的結合率均增加。當樣本加樣量為80μL時，繼續增加加樣量，結合率增加不明顯，認為此時試紙條上的免疫反應基本飽和。因此，后續實驗選擇80μL為樣本加樣量。

2.1.3 檢測時間的選擇在檢測卡加樣孔中加入80μL參考樣本，室溫下免疫反應，分別在5、10、15、20、25、30 min時檢測，考察不同檢測時間對結果的影響。結果表明，隨檢測時間的延長，各濃度點的結合率呈現增加的趨勢，在15 min時檢測能達到較高的結合率，而隨著檢測時間的延長，各濃度點的結合率不再發生較大的變化，趨于平穩或減少，說明在15 min時試紙條上的雙抗體夾心吸附基本達到飽和。因此，本著快速簡便的原則，選擇檢測時間為加樣后15 min。

2.2 檢測結果判讀加樣后，由于液體向前移動，先后與包被在T線和C線上的抗體形成復合物，這時試紙條經熒光檢測設備掃描顯示出2條熒光帶。C線熒光掃描值基本一致，T線值隨加樣中抗原濃度的增加而升高。相應的檢測結果以濃度為橫坐標，熒光值信號為縱坐標，經對數函數數據處理程序擬合得到標準曲線。當樣本為陰性時，AIV濃度很低或無，T線熒光值很低或完全檢測不到；當樣本為陽性時，AIV抗原濃度越高，T線熒光值也越高。無論是陽性還是陰性結果，C線總能顯示熒光，如果C線沒有熒光顯現，無論T線有無，這時的結果均判為無效。

2.3 AI-LFICA試劑盒的方法學評估

2.3.1 特異性試驗用AI-LFICA試劑盒分別檢測H9、H7、H5、H3亞型禽流感抗原，雞新城疫（ND）和雞傳染性支氣管炎（IB）陽性抗原，結果（表1）表明，AI（通用）-LFICA與所有亞型禽流感抗原均有反應，AI（H7）-LFICA只與H7亞型有反應；禽流感通用型和H7亞型LFICA與ND、IB陽性抗原均不發生交叉反應，顯示出很好的特異性。

表1 特異性試驗結果

2.3.2 敏感性試驗當H7亞型抗原樣本稀釋至1 280倍時，用AI（H7）-LFICA檢測仍為陽性（見 表2）。用AI（通用）-LFICA檢測不同亞型陽性抗原樣本時，不同亞型的稀釋度不一樣，最高是H5可達到5120倍，最低是H3為640倍（見表3）。證明該方法敏感性很好。

表2 禽流感H7亞型敏感性試驗結果

表3 禽流感通用型敏感性試驗結果

2.3.3 重復性試驗選擇不同濃度的8個H7陽性樣本，用AI（H7）-LFICA檢測10次，得出批內重復性試驗的變異系數均小于10%；選取不同濃度的H9、H7、H5、H3陽性樣本，用AI（通用）-LFICA分別檢測10次，得出批內重復性試驗的變異系數均小于10%。以上結果表明禽流感通用型和H7亞型LFICA試劑盒具有良好的重復性。

2.3.4 與HA、Bionote試紙條和熒光RT-PCR的比較試驗同一份H9、H7、H5陽性樣品，同時用AI-LFICA、HA、Bionote試紙條和熒光RT-PCR進行檢測，結果表明，用熒光RT-PCR檢測3種禽流感亞型的滴度達到或高于1∶40 960；AI-LFICA檢測滴度優于HA，且檢測H7的滴度明顯優于Bionote試紙條（表4）。

表4 比較試驗結果

2.3.5 試劑盒保存期試驗用一批試劑盒于37℃放置一周，每天檢測，經統計學分析得出，用AI-LFICA試劑盒檢測陽性樣品、陰性樣品、P/N值的變異系數均小于10%，表明該產品很穩定。將該試劑盒放置于4℃，每月檢測一次，目前已放置180 d，檢測效果基本一致，說明該診斷試劑盒穩定有效，進一步的穩定性試驗還在進行中。

2.3.6 試劑盒應用試驗取100份雞咽喉拭子樣品，分別用通用型試劑盒和RT-PCR方法進行檢測，得出共同陽性樣品數為2份，共同陰性樣品數為94份，由此得出兩種方法的符合率為96%。

3 討論

3.1 禽流感抗原檢測方法中，中和試驗是經典方法，但由于涉及細胞繁殖、病毒培養、染色標記等復雜操作，對實驗儀器和操作人員要求較高，加上檢測周期長，故很難在普通實驗室應用。ELISA和RT-PCR是禽流感病毒抗原檢測的主要方法，具有敏感性好和特異性強的優點，但需要比較完備的實驗設備，操作人員也得具有一定的專業技術水平和經驗，檢測一批樣品的整個流程至少需要2～4 h，對于基層獸醫站和一般實驗室不適用。本試驗建立的高敏熒光免疫分析方法（LFICA）是在時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）基礎上建立起來的一種超微量快速免疫檢測技術，它集合了酶標記技術、放射標記技術和同位素標記技術的優點，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好，無污染，測定范圍寬，試劑盒壽命長，操作簡單和非放射性等優點，已受到各領域科研工作者的關注。在人醫學界已有文獻報道，在獸醫學領域才起步，需要研究的內容和范圍還很多【1-3]。

3.2 本研究所用的單克隆抗體是整個試驗的關鍵，單克隆抗體的質量、純度、表位情況等對抗原的檢測非常重要。對比試驗結果表明，用熒光RT-PCR檢測3種亞型禽流感抗原的效果最好；AI-LFICA檢測滴度優于HA，且檢測H7的滴度優于Bionote試紙條，基本能滿足初篩需要。應用單抗建立的LFICA試劑盒對不同亞型抗原的檢測滴度不同，這可能是由單抗的表位因素決定的，如果有多株單抗同時應用，效果會更加理想。本研究建立的AI-LFICA與鄭騰等[4]和張險朋等[5的研究結果一致。

3.3 本研究建立的AI-LFICA，既具有膠體金免疫層析法（GICA）簡單、方便、適于基層的優點，又具有ELISA和RT-PCR方法敏感、特異、微量的優點，檢測時間從2～4 h縮短到十多分鐘，檢測不需要有經驗的專業技術人員，檢測設備小巧便于攜帶，尤其適用于基層獸醫部門、養殖場和技術服務人員使用。