基于HPLC結合化學計量學的銀菊合劑指紋圖譜研究

張志 呂建偉 覃開羽 吳敏 張蓓 李俊偉 王瑩 馮秀芳 盧森華

摘要：采用HLPC法，色譜柱為Agilent Eclipse-C18柱，檢測波長為330 nm，流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價結合主成分分析對10批次銀菊合劑樣品進行研究。結果表明，標定出11個共有峰，定性了3個共有峰，指紋圖譜相似度均在0.9以上，符合指紋圖譜研究技術要求，影響制劑質量差異是多成分協同作用的結果。

關鍵詞：銀菊合劑;HPLC;化學計量學;指紋圖譜

中圖分類號：O69? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）16-0110-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.025? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Using HLPC， Agilent Eclipse-C18 column， detection wavelength 330 nm， mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid gradient elution， flow rate was 1.0 mL/min. 10 batches of Yinju mixture samples were studied by similarity evaluation of chromatographic fingerprints of traditional Chinese medicine. Results showed that thirteen common peaks were calibrated and three common peaks were qualitatively identified. The similarity of fingerprints was above 0.9， which met the requirements of fingerprint technology. The synergistic effect of multi-components affected the quality of preparations.

Key words： Yinju mixture; HPLC; chemometrics; fingerprint

銀菊合劑是柳州市中醫醫院經驗方，通過多年臨床觀察證明其具良好的清熱解毒、疏散風熱作用，常用于風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、瘡毒或壯熱口渴、小兒胎毒等病癥的治療，且療效顯著。銀菊合劑組方含山銀花和菊花二味中藥，山銀花（Lonicera hypoglauca）性甘寒，歸肺、心、胃經，具有清熱解毒，涼散風熱的功效[1]，為君藥。現代藥理學研究證明，山銀花中具有抗菌、抗病毒、解熱、抗氧化及保護肝臟的作用[2，3]。山銀花的質量控制除了法定標準規定的外觀、性狀、鑒別及以綠原酸含量為指標進行質量控制外，多集中于不同產地、不同加工方法山銀花有效成分的含量測定，并越來越傾向于多種成分的同時測定[4，5];HPLC指紋圖譜可用于山銀花藥材、提取物品質的鑒定[6]。菊花[Dendranthema morifolium（Ramat. ）Tzvel.]性苦、辛、微寒，歸肝、心經，散風清熱，平肝明目，清熱解毒，以增強主藥之功效[1]，為臣藥。菊花具有抗菌、抗炎、舒血管、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[7，8]。二藥配伍，苦寒瀉火以解毒，甘寒化陰以補虛，標本兼顧，共奏清熱解毒、疏散風熱之效。中藥復方制劑成分復雜，目前采用定量部分指標性成分的方法難以全面控制其質量，中藥指紋圖譜技術有利于整體獲取中藥活性組分群，已成為中藥真偽優劣鑒別、質量一致性評價和產品穩定性考察的可行模式[9，10]。

目前，指紋圖譜結合化學計量學已被廣泛地應用于中成藥的質量控制[11]，但有關銀菊合劑指紋圖譜的研究甚少。本研究采用HPLC結合化學計量學對銀菊合劑進行指紋圖譜研究，為科學評價和有效控制銀菊合劑的質量提供參考依據，為下一步形成具有自主知識產權的成果和產業化奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 試劑? 銀菊合劑樣品來源于柳州市中醫醫院，制備銀菊合劑所用飲片購于廣西柳州醫藥股份有限公司、國藥控股柳州有限公司和廣西柳州百草堂中藥飲片廠責任有限公司，經柳州市中醫醫院藥學部中藥庫唐鳳嵐副主任中藥師鑒定：山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera Confusa DC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開的花;菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥頭狀花序，藥材形狀特征與《中國藥典》2015年版描述一致，各飲片產地來源、批號信息見表1。綠原酸（批號110753-201415）、咖啡酸（批號110885-200102）、木犀草苷（批號111720-2013）均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈、甲醇（美國Fisher公司，色譜純），磷酸（天津市光復精細化工研究所，優級純），高效液相色譜儀用水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

1.1.2? 儀器? 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;XS-205Du型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）;HH-S6型數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）;Synergy型超純水機（美國密里博公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 混合對照品溶液的配制? 分別精密稱定綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對照品10 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取上述3種對照品準備液1.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得。

1.2.2? 供試品溶液的制備? 精密量取銀菊合劑2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

1.2.3? 色譜條件? 色譜柱為Agilent Eclipse-XDB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為330 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為5 μL;流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液進行梯度洗脫（乙腈體積分數在0→5 min為10%，5→50 min為10%→90%）。

2? 結果與分析

2.1? 精密度試驗

取S1號銀菊合劑2.0 mL制備供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件連續進樣6次。結果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.03%，各色譜峰相對峰面積的RSD為0.02%～0.30%，該試驗精密度良好。

2.2? 重復性試驗

取6份S1號銀菊合劑供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進行測定，考察樣品的重復性。結果表明，6份樣品的各色譜峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.10%;各色譜峰相對峰面積的RSD為0.4%～3.7%，該方法的重復性良好。

2.3? 穩定性試驗

取供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，考察供試品溶液的穩定性。結果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.08%;各色譜峰相對峰面積的RSD為0.08%～3.60%，說明供試品溶液在24 h內具有良好的穩定性。

2.4? 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.4.1? 參照色譜峰的建立? 綠原酸為銀菊合劑中已知主要成分，而且綠原酸所在指紋圖譜中的2號峰保留時間適中，分離度良好，峰面積較大且為共有峰，故選用綠原酸（2號峰）作為參照峰，見圖1。

2.4.2? 指紋圖譜的采集[12]? 精密量取10批次的銀菊合劑2.0 mL，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，并按“1.2.3”色譜條件進行測定，記錄10批次銀菊合劑的色譜圖及數據，建立銀菊合劑HPLC指紋圖譜（圖2），10批銀菊合劑HPLC疊加色譜圖如圖3所示。

2.4.3? 共有峰的確定? 運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版》計算機軟件對指紋圖譜數據進行分析評價，10批次圖譜都具有的色譜峰標定為共有指紋圖譜峰。選擇1號銀菊合劑的圖譜為參照圖譜，以平均數法作為生成對照指紋圖譜的方法，設定時間窗寬度為0.1 min，軟件自動匹配圖譜，系統根據銀菊合劑的共有模式，生成對照指紋圖譜為銀菊合劑指紋圖譜。以參照峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算10批銀菊合劑共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2、表3。結果表明，不同批次的銀菊合劑共有峰相對保留時間RSD為0.1%～1.0%，相差較小;而相對峰面積RSD相差較大。本試驗建立的色譜方法可以使不同批次的銀菊合劑具有基本一致的色譜行為，即各批次銀菊合劑樣品在化學成分種類上基本一致，但不同批次之間各種化學成分的含量受多種因素的影響，因此各峰的峰面積有所差異，各成分的含量有差異。

2.4.4? 共有峰的指認? 利用對照品對照法對共有峰進行指認，取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對照品，配制成適量濃度，按照“1.2.3”色譜條件進行測定，結果顯示3種對照品的保留時間分別與特征色譜圖中的2、3、7號峰保留時間一致，并通過在線紫外吸收光譜對照，2、3、7號峰分別與綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對照品峰一致，因此可以確定2號峰為綠原酸、3號峰為咖啡酸、7號峰為木犀草苷，這些特征峰可作為控制銀菊合劑質量的指標之一。

2.4.5? 相似度評價? 選擇S1號銀菊合劑樣品的圖譜為參照圖譜，以平均數法作為生成對照指紋圖譜（SR）的方法，時間窗寬度設定為0.1 min，然后進行譜峰識別和譜峰匹配，結果見圖3。系統根據銀菊合劑樣品的共有模式，生成銀菊合劑對照指紋圖譜并計算相識度，結果見圖4和表4。結果表明，10批次銀菊合劑樣品與對照指紋圖譜（SR）的相似度均大于0.9，說明各批次銀菊合劑樣品圖譜與對照指紋圖譜有較好的一致性，完全符合HPLC指紋圖譜技術要求。

2.4.6? 主成分分析? 以10批次銀菊合劑樣品色譜數據的11個共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件進行主成分分析[13]，以主成分的特征根和貢獻率作為選擇主成分的依據，提取到2個主成分的特征根大于1的主成分，2個主成分特征值分別為6.690%、2.664%，方差貢獻率分別為60.814%、24.220%，且它們的累積方差貢獻率大于85.034%，結果見表5。從PCA碎石圖（圖5）可以看出，先提取出來的2個主成分的坡度較為陡峭，說明所提取的 2個主成分可以代表銀菊合劑樣品的質量。根據因子荷載矩陣，推測影響銀菊合劑樣品質量差異的并不是單一成分，而是多成分協同作用的結果。從表6和圖6中可以看出，第1主成分的信息主要來自于色譜峰 2、3、5、7、10、11的信息;第2主成分主要來自色譜峰1、4、6、8、9的信息。

3? 討論

中藥制劑的生產是一個復雜的過程，生產環節、影響因素多，生產中任何環節出現問題，均對制劑產品的安全有效造成影響。中藥自身毒性或潛在毒性、中藥之間相互作用、配伍禁忌或者臨床用藥不合理等因素會引發中藥制劑的安全問題。中藥制劑的藥材來源、處方、制備成型工藝、輔料、儲存、運輸等涉及中藥制劑的質量問題[14]。中藥制劑指紋圖譜則通過各色譜峰的峰面積或峰高比值來確定樣品中化學成分的相對量，并結合數理統計方法通過相似度的比較來評價該制劑質量的優劣，能較為全面地反映中藥制劑中所含化學成分的種類與數量，尤其是在現階段有效成分大部分未明確的情況下，能較全面地反映中藥制劑的內在質量[15]。

從10批樣品的高效液相色譜指紋圖譜中可以看出，不同批次銀菊合劑各色譜峰的相對保留時間基本一致，所含成分基本相同，符合指紋圖譜的要求。本研究建立銀菊合劑指紋圖譜，為銀菊合劑的質量控制提參考，進而對于其相應制劑的質量控制也會起積極的作用。

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