武漢市馬源腸球菌感染現狀分析

蘭彥芳　余剛　丁鵬　羅厚強

摘要：抗生素的不科學應用致使腸球菌（Enterococcus）耐藥性越發嚴重，感染率日益升高。為減少武漢市馬源腸球菌耐藥現象的發生、降低其感染率，通過查閱國內外相關文獻并進行分析，得出如下結論：①馬源腸球菌研究資料相當匱乏;②馬源腸球菌耐藥性及致病性日益嚴重。針對以上結果提出以下對策：①對武漢市各地馬匹進行腸球菌遺傳特性分析，比較不同環境對腸球菌進化的影響，為馬源腸球菌的耐藥及致病機理研究提供參考;②對馬源腸球菌主要抗生素即氨基糖苷類和萬古霉素耐藥的生物特性及遺傳背景進行探索，為控制該病原菌耐藥基因的傳播提供理論依據;③篩選馬源腸球菌主要毒力基因，并通過敲除方式探討其致病機理，為馬獸醫臨床提供參考。結合耐藥及毒力特征，制訂適合馬匹的用藥指南，降低馬獸醫臨床治療難度，為軍人運動會及馬術賽事的發展提供基礎和保障。

關鍵詞：馬源腸球菌（Enterococcus）;耐藥性;致病性;用藥指南;軍人運動會

中圖分類號：R378.1 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：1007-273X（2019）08-0005-04

腸球菌（Enterococcus）分布廣泛，正常存在于自然界中，屬于條件性致病菌[1，2]。腸球菌耐藥性復雜，抗生素的不科學應用更加加重菌株的耐藥性，從而致使腸球菌引起敗血癥、皮膚軟組織感染及心內膜炎、陰道感染等多種疾病，尤其當家畜免疫力低下時更易發生。目前，家畜感染率逐漸升高，使得養殖業等損失慘重[3]。關于馬源腸球菌引起的疾病報道雖少，但部分地區馬產業亦受到了影響。因此，本文從武漢市馬源腸球菌遺傳特性、耐藥性和致病性三個方面進行分析，挖掘馬源腸球菌耐藥及致病機理，從耐藥性和致病性兩者相關性出發對競賽馬匹制訂合理的用藥指南，旨在為武漢市乃至我國馬匹疾病的防治提供一定的科學依據。

1 ?研究背景

1.1 ?我國馬產業發展現狀

我國現代馬產業機構主要由兩部分構成：畜牧業發展的牧場和休閑俱樂部娛樂活動。隨著時代不斷進步，富貴階層人數逐漸增加，奧運會等綜合賽事大量舉行（如第七屆世界軍人運動會馬術運動），馬術（賽馬）運動在中國開始逐漸流行，直接或間接參與馬術（賽馬）的馬匹及人群亦日漸增多，因此馬產業逐漸發展為我國經濟發展轉型的新的增長點。

1.2 ?賽事馬匹的重要性

2019年世界軍人運動會將在武漢舉行，其中馬術比賽將在武漢商學院（以下簡稱武商院）進行，為此武商院已從歐洲購買29匹軍運會比賽用馬，這些馬匹不僅價值昂貴，更是因為經過調教和訓練成為了專業“運動員”，而馬匹疾病的防治也成為世界軍人運動會馬術比賽順利完成的基礎保障之一。對此我們要更加重視，應制訂科學、有效的預防和控制策略，以維護馬匹健康，助力軍運會乃至今后馬產業更好地發展。

1.3 ?地理環境差異性

武漢市屬亞熱帶季風性濕潤氣候區，具有雨量充沛，夏高溫，冬季稍涼濕潤等特點，與歐洲氣候有差異，進口馬匹易發生應激反應及免疫力低下等不良現象，這些均為軍運會競賽馬匹感染致病性腸球菌創造了有利條件。此外，馬源腸球菌耐藥性復雜，最后一道防線-萬古霉素已被突破[4]，因此可能嚴重威脅軍運會馬匹健康，甚至給馬產業帶來巨大經濟損失。

2 ?研究現狀

2.1 ?腸球菌生物學特征

不同環境、不同地區來源的菌株其基因組均存在差異性，其在進化關系中具有不同的特征[5]。因此，對腸球菌的遺傳背景進行研究，尋找不同環境來源的菌株在進化上的地位，可為馬源腸球菌的耐藥、致病機理及以后病原菌感染和致病機制研究工作提供參考。

Willems等[6]通過使用eBURST算法對腸球菌基因組MLST數據進行分析，發現絕大多數感染組分離出來的菌株屬于同一簇，稱為CC17，然而，這些傳染性分離株之間并沒有嚴格的親緣關系，而且已經相當多樣化[7]。在已測序菌株中，溶原噬菌體的多樣性是影響糞腸球菌種屬多樣性的重要原因之一。有研究發現，3個分離株獲得一個與esp基因相關的致病島（Pathogenicity island，PAI），并為該PAI在進化過程中可能發生糞腸球菌水平基因的轉移提供了證據。雖然目前糞腸球菌的毒力潛力低于其他球菌，如致病性鏈球菌和金黃色葡萄球菌，但它對抗生素的耐藥性使其成為最難治療的醫院病原體之一。糞腸球菌基因組的靈活性使其能夠有效地整合其他基因到糞腸球菌基因庫中，從而快速適應新的環境，為馬的臨床治療增加了難度[6]。

2.2 ?腸球菌的耐藥特征

腸球菌曾一直作為一種可順利應用抗生素治療的病原體，但最近幾十年多株多重耐藥菌株被發現（主要為糞腸球菌和屎腸球菌）。腸球菌細胞壁較厚，耐藥性非常復雜，包括天然耐藥性、獲得性耐藥性及耐受性耐藥性。其固有耐藥性與染色體有關，包括β-內酰胺類、頭孢菌素等;而獲得性耐藥與轉座子和質粒有關，包括紅霉素、高水平氨基糖苷類等[4]。臨床中常根據細菌細胞壁的特征并結合氨基糖苷類藥物對腸球菌感染進行聯合治療，但有報道腸球菌對高濃度氨基糖苷類抗生素產生的耐藥性增加，且慶大霉素高水平耐藥（High-level gentamicin resistance，HLGR）占了較大比例[8]，因此失去了與細胞壁活性抗菌藥物的聯合作用。同時，作為最后一道防線的萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）分離率在國內亦迅速上升，加大了治療難度。

2.3 ?腸球菌的致病性研究

腸球菌PAI是細菌染色體上具有特殊結構的基因簇，與細菌毒力及代謝產物等的編碼有關。PAIs的存在更有利于細菌的進化，為細菌對不同環境的適應性創造了有利條件[9]。PAIs屬于外來性物質，大多通過非固定性元件侵入菌體細胞內，通過各種機理進入細菌染色體的對應位點，此時宿主菌便出現新的致病性特征。這些特征可增加菌體黏附力，有利于其在腸道內易位，耐受能力增強。2002年有學者報道PAI存在于糞腸球菌中[10]，2004年PAI新結構又被Leavis等[11]懷疑存在于屎腸球菌中。PAI主要致病基因如下，細胞溶血素（Cyl）：腸球菌Cyl可溶解紅細胞，對血小板及多種細胞存在毒性作用[12];明膠酶E（gelatinase，gelE）：有研究實明gelE及其調節因子fsr參與毒力作用，與腸球菌的炎性作用密切相關[13];表面蛋白（Enterococcal surface protein，Esp）：腸球菌Esp可通過結合子途徑在種屬間轉移，幫助菌株形成生物膜，從而對氨基糖苷類藥物產生耐藥，Esp基因一直是目前國內外研究的重點;心內膜炎抗原（Endocarditis antigen，EfaA）：不同的種屬EfaA基因序列均有明顯差異。目前EfaA基因的致病性在糞腸球菌中已被報道，但在其他腸球菌中并未研究出結果;聚集物質（Aggregation substance，AS）：AS基因可引起質粒傳遞，在躲避宿主免疫反應中作用極大。此外，還有膠原結合蛋白（Adhesin of collagen. from Enterococcus，Ace）和透明質酸酶（Hayluronidase，Hyl）等也是腸球菌毒力因子之一[11]。

2.4 ?馬源腸球菌的流行病學分析

馬源腸球菌相關報道在國內外均相當匱乏。通過閱讀相關文獻及查閱相關資料發現，僅有少數國家和地區對該病原菌耐藥性及致病性有所研究，耐藥基因及毒力基因分子學研究信息資源更是相對缺乏。

2.4.1 ?馬源腸球菌耐藥性分析 ?2007 年Lleo等[14]曾報道，在不利條件下，腸球菌會處于休眠狀態，但仍保留一定的生物學特性，菌株能夠從這種狀態中復蘇并恢復主動感染和抗菌素耐藥特性;同年，De 等[15]報道在馬匹的臨床治療中有些并沒有使用糖苷類藥物，卻在馬身上發現了VRE。然而，Weese等[16]在荷蘭馬臨床樣本微生物學診斷中發現腸球菌分離物的百分比從2002年的0上升到2008年的37%;雖然萬古霉素一般不用于馬科醫學，但它有時作為一種治療替代品具有獨特的療效，因此vanA-enterococci的存在就成為一個嚴重的臨床問題[17]。2008年，Laukova等[18]發現，耐萬古霉素腸球菌在馬場分離株中比例高達 37.2%，但萬古霉素耐藥基因檢測為陰性。從健康和患病的馬的糞便中分離出的腸球菌對抗生素的耐藥性已經在先前研究中得到了評估并被報道[19];2010 年，葡萄牙學者研究發現，可以在糞便中檢測出vanA-enterococci，并可能會傳播給其他動物的耐藥細菌宿主，耐藥決定因素和耐藥細菌可以在局部地區和全球范圍內輕松傳播，從而增強耐藥性的出現[20]。

2.4.2 ?馬源腸球菌致病性分析 ?2007年，Lleo等[14]報道曾有一匹小馬因感染糞腸球菌而發病，糞腸球菌還能形成生物膜，以避開宿主的防御，增加治療難度;2009年，美國科學家曾報道某騎師因鉛黃腸球菌入侵而患眼內炎[21];2010年，Taylor等[22]報道在9%的肌肉骨骼敗血癥病例中分離出腸球菌;2012 年，Herdan等[23]首次報道新西蘭有3匹外傷馬匹由于繼發感染多重耐藥性腸球菌而引起滑膜敗血癥;2013年，部分韓國學者對100多家馬術俱樂部進行馬源腸球菌特征分析，通過抗微生物（AR）圖譜顯示：AR腸球菌的平均比例為23.8%，分別在51.1%和47.7%的分離株中觀察到生物膜的形成和凝膠酶的活性;大多數是攜帶gelE基因的糞腸球菌，提供了AR腸球菌在馬及其環境之間傳播的證據，強調了AR腸球菌通過密切接觸傳播給騎手和操作者的風險，并闡明了AR腸球菌向人類傳播的風險[24]。2017 年，有學者對新疆馬的人畜共患病進行流行病學調查，結果顯示，馬源糞腸球菌的陽性率約為15%，毒力基因檢出率為40%～80%，給當地經濟造成了一定的潛在性威脅[25]。有研究顯示，致病菌株往往具有多重耐藥性，并表現出溶血、細胞外明膠酶和膠原蛋白黏附等毒力因子，且腸球菌株耐藥的嚴重性直接影響其致病性[26]。

3 ?研究結果

通過查閱相關文獻并進行分析總結得出以下結果：①馬源腸球菌耐藥及致病研究資料相當匱乏;②馬源腸球菌耐藥性及致病性日益嚴重，對馬產業發展存在一定的潛在威脅性，應引起學者的高度重視。

4 ?對策及分析

4.1 ?馬源腸球菌的遺傳特性

分離培養主要腸球菌，采用全基因組抽取法進行全基因組DNA提取，通過1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳對基因組DNA濃度進行估測，并用Biodrop進行定量。其純度和濃度都達到測序要求后進行全基因組測序。采用各種相關軟件對不同地區、不同株的腸球菌進行基因組差異和進化關系等研究，分析不同來源的菌株在進化樹上的特征。應用脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多位點序列分型（MLST）技術進行遺傳背景研究，尋找病原菌及耐藥菌株在進化上的地位，為以后病原菌感染和致病機制研究工作提供參考。該方法可系統性地從分子水平對武漢市各地馬匹進行腸球菌遺傳特性分析，比較不同環境對腸球菌進化的影響，從而為馬源腸球菌的耐藥及致病機理研究提供參考。

4.2 ?馬源腸球菌耐藥特性

對腸球菌主要抗生素進行耐藥表型檢測，對鑒定出的腸球菌采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC），并統計分析其耐藥情況;對耐藥菌株進行耐藥基因檢測（主要為氨基糖苷類藥物和萬古霉素），統計分析耐藥基因與耐藥表型的相關性;由于HLGR及VRE的分離率在國內迅速上升，故可對臨床中馬源HLGR、VRE菌株耐藥表型、耐藥基因和耐藥傳播機制進行研究，為HLGR、VRE感染的防治提供基礎。該方法可從基因學層面對馬源腸球菌主要抗生素即氨基糖苷類和萬古霉素耐藥的生物學特性及遺傳背景進行探索，有利于控制耐藥基因的傳播，降低馬產業經濟因腸球菌抗生素嚴重耐藥導致的損失。

4.3 ?馬源腸球菌毒力特性

糞腸球菌致病島是由許多毒力基因組成的基因簇，是腸球菌致病的來源，因此可對各毒力基因分布特征進行研究，從而為以后致病性腸球菌的研究打下基礎。

膠原結合蛋白ace是腸球菌表面識別黏附基質的一類蛋白分子，它能介導腸球菌黏附在宿主細胞的外基質蛋白之上，是腸球菌重要致病因子之一。然而目前對馬源腸球菌的研究并不多，尤其毒力因子ace的研究更少。為研究ace基因對腸球菌的致病性影響情況，可選取武漢市馬源腸球菌為研究對象，構建腸球菌ace基因突變菌株，研究ace基因在腸球菌感染中的分子機制，探討ace基因在菌體致病表達中的作用，為馬臨床腸球菌致病機制的研究等提供理論基礎。

4.4 ?制訂馬匹用藥指南

最后，根據其耐藥及致病結果篩選出馬匹最佳用藥方案，制訂合理的馬匹用藥指南，從而減少因濫用抗生素而增加臨床中馬匹治療難度的困擾。該內容為保證競賽馬匹健康提供了一定的理論基礎，同時也為順利完成第七屆世界軍人運動會馬術賽事提供了一定的服務保障。

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