甲基硫菌靈及其代謝產物多菌靈在芒果上的殘留測定及膳食風險評估

張 月， 張 群， 趙方方， 韓丙軍， 黃海珠

(1.中國熱帶農業科學院 分析測試中心，海南 海口，571101； 2.海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室，海南 海口，571101； 3.農業農村部熱作產品質量安全風險評估實驗室，海南 海口 571101)

甲基硫菌靈(Thiophanate-methyl)是日本曹達公司開發的一種廣譜內吸苯并咪唑類殺菌劑[1]，該藥劑被植物吸收后，通過一系列的生化反應轉化為另一種苯并咪唑類殺菌劑多菌靈(Carbendazim)，進而干擾菌類紡錘體的形成，使病菌萌發的芽管異常，從而起到殺菌作用。可用于防治果樹和花卉黑星病、炭疽病，對玉米大、小斑病也具有良好的防效[2-6]。甲基硫菌靈降解速度慢，殘效期長，隨著農藥廣泛應用到水果、蔬菜和菌類作物后，產生的環境污染、農藥殘留問題也引起人們越來越多的關注[7-9]。國際食品法典委員會(CAC)規定：甲基硫菌靈的殘留定義為甲基硫菌靈和多菌靈殘留量之和，我國還沒有甲基硫菌靈在芒果上的殘留限量值。目前，我國關于各類農藥殘留的檢測方法較多，主要有紫外分光光度法[10]、超高效液相色譜法[11-15]、固相微萃取法、TurboFlow在線凈化[16]、液相色譜-串聯質譜法[17-18]等。但甲基硫菌靈及其代謝產物在芒果中的殘留降解尚未見報道。鑒于此，利用優化后的QuEChERS前處理方法和高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析法，對甲基硫菌靈及代謝物多菌靈在芒果中的殘留進行測定，對其消解規律以及最終殘留量進行研究，并對甲基硫菌靈行進膳食風險評估，以期為芒果質量安全提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種 供試芒果品種為臺農與金鳳凰。

1.1.2 儀器 液相色譜-串聯質譜儀(Waters液相和AB Sciex質譜)，高速冷凍離心機(HITACHI CR22N日本日立)，渦旋振蕩器XH-J型(南京東邁科技儀器有限公司)，IKAT25高速分散勻漿機(上海萬捷科技有限公司)。

1.1.3 藥品與試劑 供試農藥為500 g/L甲基硫菌靈懸浮劑。甲基硫菌靈(純度99.0%，Labor Dr. Ehrenstorfer- Schafers·Bgm)，多菌靈(純度99.5%，Labor Dr. Ehrenstorfer- Schafers·Bgm)，乙腈(HPLC，Thermofisher)，氯化鈉(AR，上海國藥)，PSA(美國安捷倫)，甲酸(Thermofisher)，超純水(實驗室自制)。

1.2 試驗設計

田間試驗于2015和2016年分別在海南和云南進行。其中海南種植芒果品種為臺農，云南種植芒果品種為金鳳凰，按《農藥殘留試驗準則》[19]和《農藥登記殘留田間試驗標準操作規程》[20]要求設置芒果試驗小區，試驗小區按施藥劑量(低劑量和高劑量)及施藥次數(2次，3次)設置，各處理3次重復，共12個小區，每小區種植4棵樹，小區間設置隔離區，另設空白對照小區。

1.2.1 消解動態試驗 在芒果果實生長至一半大小時，采用噴霧法噴施500 g/L甲基硫菌懸浮劑937.5 mg/kg，施藥1次，施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和28 d采集芒果全果樣品，重復3次。以隨機方式在小區內用采集樣品，在試驗小區(樹)的不同方向(不同部位)采集2 kg生長正常、無病害的芒果全果，裝入樣本容器中包扎妥當，待用。

1.2.2 最終殘留試驗 試驗設低劑量和高劑量2個處理，低劑量為625 mg/kg(800倍液)，高劑量為937.5 mg/kg(533.3倍液)，不同劑量處理均分別施藥2次和3次，3次重復，小區間設保護隔離區，按照試驗設計時間開始第1次施藥，施藥間隔期為7 d，最后1次施藥后5 d、7 d和10 d分別采集不同處理不同小區的芒果全果進行測定。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取 稱取5.0 g已打碎的芒果全果樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，勻漿2 min，再加入7 g的氯化鈉，于渦旋儀上渦旋振蕩至完全混勻后，置于離心機上，以4 000 r/min的速度離心3 min，待凈化。

1.3.2 凈化過程 分別吸取5 mL樣品乙腈提取液加入到15 mLPSA管中，再置于10 000 r/min的高速冷凍離心機上離心3 min，過0.22 μm濾膜后用液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 液相色譜分析條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫35 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣體積2.0 μL，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源ESI正離子模式掃描，MRM模式檢測，參數設置：碰撞氣CAD=6，氣簾氣(CUR)=20 psi，霧化氣(GS1，GS2)=50 psi，噴霧電壓(IS)=5 500 V，離子源溫度(TEM)=600.0℃。選擇性離子監測參數見表2。

1.4.3 方法檢出限及定量限 基于最小線性質量濃度的基質標樣色譜圖，按3倍信噪比計算得出甲的檢出限(LOD，S/N=3)，以最小添加水平為定量限(LOQ)。

表2 串聯質譜監測模式下待測化合物的檢測條件

1.4.4 方法學考察 稱取芒果空白樣品，每組5個重復，在空白樣品中添加甲基硫菌靈和多菌靈的質量分數為0.01 mg/kg、0.10 mg/kg和1.0 mg/kg進行添加回收率試驗，按照1.3、1.4.1和1.4.2的方法進行分析。

1.5 風險評估

根據文獻[21-22]，甲基硫菌靈的毒理學數據，ADI為0.08 mg/(kg·bw·d)，甲基硫菌靈在芒果中的最大殘留限量是1.0 mg/kg。

1.5.1 長期膳食攝入風險評估 長期膳食攝入評估是在毒理學和殘留化學評估的基礎上，對居民因膳食攝入帶來的農藥殘留對身體健康造成的風險進行定量評價。我國的膳食攝入量主要依據衛生部2002年發布的《中國不同人群消費膳食分組食譜》[23]規定了一般人群某種食品的消費量，包括蔬菜、糧谷類、薯類、千豆及豆制品、水果、畜禽類、奶及奶制品、蛋及蛋制品、魚奸類、植物油、動物油、糖及淀粉、食鹽、醬油等各種食品的每人每日允許攝入量。確定人群的膳食結構和食品消費量，再分別結合殘留化學評估推薦的規范STMR或己制定的MRL，計算出國家估算每日攝入量(NEDI)，結合本試驗的結果對甲基硫菌靈進行風險評估。

NEDI=∑Fi×CMRL-i

(1)

風險概率=∑NEDI/(ADI×63)×100%

(2)

式中，NEDI為農藥的國家估算每日攝入量[m g /(kg·bw·d)]，CMRL-i為第i類農產品的農藥殘留最大限量值(mg/kg)，Fi為第i類農產品的每人每日平均攝入量[23]。

當風險概率小于100時，提示風險是可接受的，保護水平高。當風險概率大于100時，對消費者健康有不可接受的風險，提示保護水平低。農藥的ADI值引用自GB 2763-2016及CAC標準。63為成年人平均體重(kg)[24]。

1.5.2 急性膳食攝入風險評估 用公式(3)計算國家估計短期攝入量，公式(4)和(5)計算農藥急性膳食攝入風險(%ARfD)。

(3)

(4)

(5)

根據世界衛生組織數據，芒果單果重Ue 取0.288 8 kg，芒果個體之間變異因子v取值為3[25]。式中NESTI為國家估計短期攝入量[mg/(kg· bw·d)]；LP為芒果消費的大份餐(kg/d),HR為最高殘留量(mg/kg),Ue為芒果單果質量(kg),v為芒果個體之間變異因子。ARfD為急性參考劑量[mg/(kg·bw·d)]。當%ARfD≤100%時，表示急性膳食攝入風險可以接受，%ARfD越小，風險越小；反之，當%ARfD>100%時，表示有不可接受的急性風險，%ARfD越大，風險越大。

2 結果與分析

2.1 線性范圍、檢出限及定量限

從表3可知，甲基硫菌靈和多菌靈的定量離子色譜峰面積(y)均分別與進樣質量濃度(x)呈線性相關。甲基硫菌靈和多菌靈在芒果中的定量限(LOQ)和檢出限(LOD)均分別為0.01 mg/kg和4.0 pg。

表3 甲基硫菌靈和多菌靈的線性方程、定量限和檢出限

2.2 方法學考察

從表4可知，甲基硫菌靈和多菌靈平均回收率分別為84.7%～112.0%和79.2%～103.0%，RSD分別為2.7%～5.8%和3.0%～4.4%。根據《農藥殘留試驗準則》[19]，0.01<農藥殘留量≤0.1，回收率在70%～120%，RSD≤20%，0.1<農藥殘留量≤1，回收率在70%～110%，RSD≤15%，測定方法的回收率和RSD均在標準范圍內，說明該檢測方法可靠，適用于芒果中的甲基硫菌靈和多菌靈的檢測。

表4甲基硫菌靈和多菌靈在芒果樣品中的回收率和相對標準偏差(n=5)

Table 4 Recovery and relative standard deviation of thiophanate-methyl and carbendazim in mango samples (n=5)

化合物Compounds添加水平/(mg/kg)Adding level平均回收率/%Averagerecovery rateRSD/%甲基硫菌靈 Thiophanate methyl0.0184.74.20.10112.002.71.00104.005.8多菌靈 Carbendazim0.01103.004.40.1079.203.01.0087.103.8

2.3 甲基硫菌靈在芒果中的消解動態

種植于海南的芒果甲基硫菌靈(以多菌靈計)的消解半衰期在2015和2016年分別為9.5 d和9.9 d，消解動態方程分別為y=1.254 5e-0.073x和y=0.609 8e-0.07x，相關系數分別為0.930 7和0.856 1；種植于云南的芒果甲基硫菌靈(以多菌靈計)的消解半衰期在2015和2016年分別為12.6 d和9.8 d，消解動態方程分別為y=3.013 4e-0.055x和y=1.679 5e-0.071x，相關系數分別為0.969 4和0.859 1，甲基硫菌靈(以多菌靈計)在芒果中的消解動態符合一級動力學方程。

2.4 最終殘留

由表5可知，在海南、云南試驗點，芒果中的甲基硫菌靈殘留量均表現為高劑量殘留量高于低劑量殘留量，3次施藥高于2次施藥，施藥后7 d，采收時，甲基硫菌靈在芒果中的殘留中值為 0.410 mg/kg，殘留最大值為0.993 mg/kg，低于歐盟中甲基硫菌靈在芒果上的MRL值1.0 mg/kg。

表5施藥后7d甲基硫菌靈在芒果中的殘留量

Table 5 Residues of thiophanate-methyl in mango after seven days of application

年份Year地點 Location施藥劑量/(mg/kg) Dosage施藥次數/次Application frequency殘留量/(mg/kg)Residue2015年海南62520.15330.239937.520.58730.5472016年海南62520.39430.290937.520.48030.8062015年云南62520.57630.789937.520.83130.9932016年云南62520.12030.200937.520.19130.206

2.5 風險評估

2.5.1 長期膳食攝入風險評估 在對甲基硫菌靈(以多菌靈計)現有MRL標準對消費者的保護水平進行評估時，其MRL值優先取值我國標準，根據GB 2763—2016食品中農藥最大殘留限量[22]及《食品中農藥最大殘留限量》的統計，制定的甲基硫菌靈(以多菌靈計)殘留限量的食物種類、相應MRL和限量來源(表6)，結合中國農藥登記情況和中國居民人均膳食結構，得到普通人群甲基硫菌靈的每日理論最大攝入量為2.020 970 9 mg，占日允許攝入量的5.04%，風險概率為40.10%，表明現行甲基硫菌靈MRL標準對消費者在長期攝入風險方面的保護程度高，通常不會對一般人群健康產生不可接受的風險。

2.5.2 農藥殘留急性風險評估 試驗最高殘留量采用所有處理中殘留量的最大值 0.993 mg/kg，芒果單個食品質量取 WHO (世界衛生組織)提供的各國的平均值 0.288 8 kg[23]，甲基硫菌靈的ARfD值采用 2017年JMPR報告確定的1 mg/(kg ·bw·d)[25]進行計算。結果 (表7)表明,芒果中甲基硫菌靈殘留對中國各類人群的短期膳食攝入暴露量為 0.002 5～0.013 0 mg/(kg ·bw·d)，雖然不同人群的評估結果有差異，兒童 (≤ 6歲)的暴露量高于其他人群，但總體均較低，僅占急性參考劑量ARfD的 0.25%～1.30%，遠低于 100%，說明急性風險很低，而且基于殘留試驗獲得的甲基硫菌靈殘留水平均遠低于芒果中甲基硫菌靈殘留在一般人群和兒童中的安全界限。

表7 甲基硫菌靈的急性風險評估

3 結論

試驗采用高效液相色譜-質譜串聯法對芒果中甲基硫菌靈及代謝產物多菌靈額殘留進行測定，該方法重現性良好，靈敏度高，準確度與精確度均符合農藥殘留檢測分析的要求。甲基硫菌靈在芒果中的消解動態符合一級動力學方程，海南芒果甲基硫菌靈半衰期2015年和2016年分別為 9.5 d和9.9 d，云南芒果甲基硫菌靈半衰期分別為12.6 d和9.8 d；最終殘留試驗結果表明，2015年和2016年施藥后間隔期7 d，采收時，甲基硫菌靈在芒果中的殘留中值為 0.410 mg/kg，低于歐盟中甲基硫菌靈在芒果上的MRL值(1.0 mg/kg)。芒果中甲基硫菌靈殘留帶來的膳食攝入風險和急性膳食攝入風險均很低，在可接受范圍內。以上結果可為制定甲基硫菌靈在芒果中的使用規程、規范甲基硫菌靈在芒果中的使用、制定其MRL值及其加強對甲基硫菌靈殘留的監管提供理論基礎和依據。