64Cu標記DKFZ-PSMA-617探針的制備、質控及體內分布的研究

朱 華，劉特立，王 風，蔣金泉，韓雪迪，楊 志

(北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所 核醫學科 惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142)

前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)高表達于前列腺癌及其轉移病灶中，其表達程度與前列腺癌的發生、發展相關。PSMA作為前列腺癌診斷和治療的一個重要靶點，已得到了業內的關注，一系列靶向PSMA的小分子抑制劑已被用于前列腺癌的診斷和治療[1-4]。

基于前列腺癌組織代謝及特異靶點的PET分子影像可活體、無創顯示腫瘤細胞內生化代謝異常和細胞特征靶點分子表達的變化，為腫瘤病灶探測、療效評估及腫瘤細胞生物學特性的認識提供技術手段。多種PET核素標記的PSMA特異性化合物，如N-[N-[(S)-1,3-二羧基丙烷] 氨甲酰基]-4-[18F]氟代芐基-L-半胱氨酸，N-[N-[(S)-1,3-Dicarboxypropyl]carbamoyl]-4-[18F]fluorobenzyl-L-cysteine(18F-DCFBC)，1-氨基-3-氟環丁烷-1-羧酸，anti-1-amino-3-18F- fluorocyclobutane-1-carboxylic acid(18F-DCFPyL)，N,N′-雙[2-羥基-5-(羧乙基)芐基]乙二胺-N,N′-二乙酸， N,N′-bis[2-hydroxy-5- (carboxyethyl)benzyl]ethylenediamine-N,N′-diacetic acid(68Ga-PSMA-HBED-CC)，(S)-2-(3-((S)-1-羧基-5-(3-(4-[123I]碘苯胺) 脲基)戊基)脲基)戊二酸，(S)-2-(3-((S)-1-carboxy-5-(3-(4-iodophenyl)ureido) pentyl)ureido)pentanedioic(99mTc-MIP-1095),68Ga-DKFZ-PSMA-617 已經成功應用于臨床[5-9]。

64Cu(T1/2=12.7 h,β-:39%[Eβ-max=573 keV]，β+:17.4%[Eβ+max=656 keV])被國際原子能機構(IAEA)稱為“下一代PET核素”，64Cu核素的衰變過程中放出即利于診斷的射線又利于治療的粒子，有診療一體化的優勢，具有廣闊的發展前景[10-11]。64Cu標記方法簡單、成熟，標記條件溫和，適用于多種小分子、多肽及單克隆抗體標記。且其具有較長的物理半衰期，適合在一定距離內的藥物配送。本課題組借助于帶有固體靶系統的HM-20醫用加速器，已在國內率先展開64Cu的生產和小分子、多肽及單抗的標記與評價[12-16]。本研究中，考慮到DKFZ-PSMA-617中含有DOTA螯合劑，設計利用64Cu標記DKFZ-PSMA-617的研究，擬為前列腺癌的診斷及治療提供理論參考。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

DKFZ-PSMA-617：ABX；乙醇：北京化學試劑有限公司；三氟乙酸、醋酸鈉：中國國藥集團有限公司；乙腈：Merck。所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

10、200、1 000 μL移液器：德國eppendorf；Sep-pak C-18柱：德國waters公司；高效液相色譜(HPLC)：1200系列，美國安捷倫公司；放射性薄層色譜掃描儀(Radio-TLC)：AR2000， 美國Bio-Scan公司；Hypersil BDS C-18反向色譜柱：5 μm，250.0 mm×4.6 mm，日本株式會社YMC；全自動伽瑪計數儀：多探頭，美國Wizard2；放射性測量活度計：美國Capintec。64Cu2+由本實驗室采用64Ni(p, n)64Cu 反應自行生產，比活度大于5.6 GBq/μmol,體積濃度3.7 MBq/μL,生產情況詳見文獻[15]。

1.3 實驗動物

Balb/c裸鼠：20只，6周，雌性，北京華阜康生物科技股份有限公司。實驗過程遵從北京腫瘤醫院實驗動物操作規范，倫理批準號：2015KT08，實驗動物飼養于北京腫瘤醫院實驗動物房(許可證號：SCXK(京)2014-004)。

2 實驗方法

2.1 64Cu-PSMA-617制備

64Cu-PSMA-617放射性標記示于圖1。取10 μL 2 g/L DKFZ-PSMA-617于一試管中，加入10～50 μL64Cu2+(3.7 MBq/μL)溶液，反應體系為pH 5.5的0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液，于65 ℃孵育器中反應10 min。結束后待體系溫度降至室溫，以2 mL注射器取出反應產物，加至已活化的Sep-pak C18柱，用3 mL 純水沖洗，通過0.2 μm微孔濾膜，以1.0 mL 80%的乙醇溶液收集產物至無菌真空瓶中；使用N2將體系中乙醇吹干，之后向真空瓶中加入1.0 mL生理鹽水，測定放射性活度，待用。

2.2 64Cu-PSMA-617質控

純化前后分別取2 μL產物滴至iTLC-SG試紙(試紙寬度為1 cm)下端1 cm處，置于展開體系(V甲醇∶V醋酸銨=1∶1)中，待產物展開至距下端10 cm處時取出晾干，進行快速薄層掃描分析，并計算保留值(Rf)。

HPLC采用YMC-Pack ODS反向柱(5.0 μm，250 mm×4.6 mm)，流動相為體積分數0.1%三氟乙酸的水溶液(A相)與體積分數0.1%乙腈的三氟乙酸溶液(B相)，分析過程采用梯度流動相，0 min至10 min B相由15%增加至60%，流速為1.0 mL/min，柱溫20 ℃，觀察放射性峰的保留時間。

2.3 體外穩定性測試

取標記產物64Cu-PSMA-617溶液適量，分別加至1.0 mL生理鹽水和5%人血清白蛋白兩溶液中，置于37 ℃孵育。分別于5、30、50、70 min和28 h后取出適量體積的生理鹽水體系中標記產物，加入進樣瓶中，調節進樣量使放射性活度為 37～74 kBq，進行Radio-HPLC分析，測定放化純度。

2.4 異常毒性實驗

異常毒性實驗為判斷是否有生產過程引入或其他原因所致的毒性。取小鼠5 只，體重18～22 g，每只小鼠分別靜脈注射0.5 mL放射性活度為1.85 MBq的64Cu-PSMA-617，且在4～5 s內勻速注射完畢。48 h內觀察小鼠存活情況。

2.5 生物分布及安全性測定

準備16只正常昆明小鼠，隨機分為四組，分別進行1、24、48 h生物分布研究。每只正常鼠均經尾靜脈注射1.85 MBq64Cu-PSMA-617，在注射后對應時間點進行處理。眼球取血后斷頸處死小鼠，解剖獲得心臟、肝臟、脾臟、雙側腎臟、肌肉(股骨中斷附著處)、中上段股骨和大腦組織，對取得器官和組織進行稱重，然后置于γ-counter管中進行計數。取小鼠注射劑量的1%為標準樣，同時進行計數測定；數據通過excel和prism軟件計算和分析。

圖1 64Cu-PSMA-617的放射性標記結構示意圖Fig.1 Scheme illustration of 64Cu-PSMA-617 radio-labeling

3 結果與討論

3.1 標記與質控

64Cu-PSMA-617標記率在反應溫度65 ℃，反應時間10 min時即高于96.0%。標記物64Cu-PSMA-617為無色透明溶液，pH在5.5～7.0之間。Radio-TLC顯示，64Cu-PSMA-617的Rf值約為0.6(圖2b)，無明顯膠體出現(膠體的Rf=0.0～0.1 )，無明顯64Cu殘留(64Cu的Rf=0.9～1.0 )(圖2a)。

由圖2c-d可知，64CuCl2的保留時間為4.0 min，目標化合物64Cu-PSMA-617的保留時間為8.7min (其前體化合物DKFZ-PSMA-617保留時間為8.1 min)，放化純度大于97%，可不經純化直接使用，適合進一步的生物學評價。

圖2 64Cu-PSMA-617的 Radio-TLC(a、b)和Radio-HPLC分析(c)及非放射性DKFZ-PSMA-617的 HPLC 分析圖(d)Fig.2 Radio-TLC analysis of 64Cu-PSMA-617 (a, b) and Radio-HPLC analysis of 64Cu-PSMA-617 (c) and it’s precursor DKFZ-PSMA-617 (d)

3.2 穩定性和毒性測試

將純化后的放射性探針置于不同緩沖體系中，取適量分別進行HPLC分析，在8.3 min時出現標記產物的放射性峰，而64Cu未見4～5 min之間的放射性峰。在生理鹽水和5%人血清白蛋白體系于37 ℃孵育兩個半衰期(T1/2=12.7 h)后，取樣品適量進行Radio-HPLC測定，采用梯度流動相分析，結果僅有少量64Cu解離，即64Cu-PSMA-617在生理鹽水體系及5%人血清白蛋白體系24 h后仍維持92%～94%的放化純度(圖3)，證實該體外環境下標記產物具有較好的穩定性。

實驗前及實驗后均在正常飼養條件下飼養，尾靜脈注射48 h內持續觀察小鼠狀態，直至48 h觀察見所有小鼠均存活，未見異常，證實藥物并無異常毒性，即放射性核素淋洗及標記產物制備過程中未污染外源性毒性物質，放射性標記產物64Cu-PSMA-617有望用于臨床轉化。

圖3 64Cu-PSMA-617在不同緩沖液條件下的體外穩定性測試Fig.3 In-vitro stability test of 64Cu-PSMA-617 in each buffer

3.3 體內分布情況

正常Balb/c小鼠經尾靜脈注射64Cu-PSMA-617 1、24、48 h的各臟器生物分布示于圖4。誤差線代表標準差(standard deviation)值。

圖4 64Cu-PSMA-617在正常Balb/c小鼠的體內分布情況Fig.4 Bio-distribution studies of 64Cu-PSMA-617 in normal Balb/c mice

由圖4結果可見，隨時間的延長在肝臟、腎臟、胃等器官中的放射性攝取逐漸降低。其中肝臟和腎臟有較高水平攝取，腎臟的放射性攝取主要由于分子探針的水溶性特征以及腎臟中高密度的PSMA非特異性受體表達。肝臟中較高水平的攝取與該分子探針的螯合基團及肝臟中的多種代謝酶有關，該探針為DOTA螯合基團，其對64Cu的偶聯易被肝臟中的一些氨基酸競爭性解離，并滯留于肝臟。在腎臟部位，由于腎臟中有較高的PSMA表達，其富集不僅是由于代謝造成的，特異性的腎臟攝取也占據一部分。因此，通過新型試劑或者助劑的開發，降低腎臟攝取非常關鍵。此外，其余器官的攝取水平均較低，放射性本底水平較低利于腫瘤的觀察與顯像。

本項目，發揮本單位能夠生產高比活度的64Cu的優勢，考慮到DKFZ-PSMA-617中含有DOTA螯合劑的實際情況，設計出利用64Cu標記DKFZ-PSMA-617的研究，而且64Cu核素的衰變過程中即放出利于診斷的射線，又有利于治療的粒子，有診療一體化的優勢，因此本研究對64Cu標記DKFZ-PSMA-617進行前期研究從而為過渡到治療提供更多理論依據。

4 小結

利用固體靶系統制備的64Cu標記PSMA-617，標記條件pH 5.5和反應溫度65 ℃可實現95%以上的標記率，經Radio-TLC/HPLC測定放化純度較高。標記化合物在多種緩沖液中放置24 h依然保持原有純度。經過尾部靜脈注射到小鼠體內后，放射性主要積累在肝臟/腎臟部位，符合該探針在生物體內的代謝行為。探針得益于64Cu核素較長的物理半衰期，64Cu-PSMA-617有助于顯示腫瘤更多新陳代謝的病理生理學特性，有望為前列腺癌和其他PSMA陽性實體瘤的治療提供更多前期依據。