p62、p16和Ki-67在乳腺癌中的表達及臨床意義

周成美 程新宇

(1錦州醫科大學第三臨床學院2015級本科生，遼寧 錦州 110032；2沈陽醫學院附屬中心醫院病理科)

研究發現〔1〕乳腺癌的發生是多因素共同參與、多個分化階段及多基因表達水平異常的復雜過程。自噬可清除受損的細胞器抑制腫瘤形成，而自噬缺陷可以導致腫瘤的發生，自噬相關蛋白p62由C-Myc編碼，在細胞質中合成定位于細胞核的一種多功能泛素化結合蛋白〔2〕，具有選擇性自噬功能在一定程度上反映了自噬活性〔3〕。抑癌基因p16是細胞周期調控因子，其失活及突變與多種腫瘤發生及發展密切相關。增殖指數(Ki-67)是細胞增殖的重要標志，常可作為預測惡性腫瘤發展及預后的指標。本文主要應用免疫組織化學SP法檢測乳腺癌及癌旁正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤中p62、p16和Ki-67表達差異，探討三者與患者臨床病理特征的關系，為乳腺癌治療及預后提供新的研究靶點。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取2016年1月至2017年12月沈陽醫學院附屬中心醫院病理科79例乳腺癌標本(乳腺癌組)和20例相應距腫瘤組織5 cm以上的癌旁正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤標本(對照組)。乳腺癌組中三陰乳腺癌39例，非三陰乳腺癌40例。所有患者臨床病理資料存檔完整。患者年齡30～78歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑≤2 cm 26例，腫瘤直徑>2 cm 53例；組織學分級Ⅰ級2例，Ⅱ級54例，Ⅲ級23例；有淋巴結轉移33例，無淋巴結轉移46例。患者經免疫組織化學檢測時均未經放化療。

1.2主要試劑 通用型p62鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；p16、Ki-67、雌激素受體(ER)和SP試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3免疫組織化學SP法染色 乳腺癌患者腫物切除后均使用10%的中性甲醛固定，依據病理規定規范取材，石蠟包埋，4 μm連續切片，常規石蠟脫水，抗原高壓修復，室溫冷卻30 min；每張切片均按照免疫組化SP法操作流程制作，DAB顯色，鏡下觀察后自來水沖洗，蘇木素復染，磷酸鹽緩沖液(PBS)或自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌標本切片作陽性對照。

1.4結果判讀 免疫組化切片均由兩位經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法單獨判讀。p62 陽性結果判讀標準：p62陽性表達為出現棕黃色顆粒定位于細胞質。p16陽性判斷標準：陽性表達定位于細胞質。Ki-67陽性判斷標準：陽性表達定位于細胞核。在高倍鏡下任意計數5個視野，每次選取200個細胞進行觀察，按陽性細胞所占百分比計分，評分標準為〔4〕:0分為無陽性細胞；1分為陽性細胞<10%；2分為陽性細胞10%～30%；3分為陽性細胞>30%。按染色強度計分：不著色為0分；淡黃色計1分；黃色計2分；棕黃色計3分。陽性細胞百分比計分與染色強度計分的乘積:0～2分為陰性，3～9分為陽性。ER陽性結果判斷標準：ER陽性表達定位于細胞核。

1.5統計學分析 應用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1p62、p16和Ki-67在乳腺組織中表達 乳腺癌組p62陽性表達位于細胞質，呈棕黃色(圖1、2)，三陰乳腺癌陽性表達率為69.2%(27/39)、非三陰乳腺癌陽性表達率為47.5%(19/40)，乳腺癌組58.2%(46/79)明顯高于對照組〔10%(2/20)〕，差異有統計學意義(χ2=6.487,P<0.05)；乳腺癌組p16陽性表達位于細胞質，呈棕黃色(圖3、4)，三陰乳腺癌陽性表達率為71.1%(28/39)、非三陰乳腺癌陽性表達率為42.5%(17/40)，乳腺癌組〔56.9%(45/79)〕明顯高于對照組〔5%(1/20)〕，差異有統計學意義(χ2=8.815,P<0.01)；乳腺癌組Ki-67陽性表達位于細胞核，呈棕黃色(圖5、6)，三陰乳腺癌陽性表達率為76.9%(30/39)、非三陰乳腺癌陽性表達率為27.5%(11/40)，乳腺癌組〔51.8%(41/79)〕明顯高于對照組〔5%(1/20)〕，差異有統計學意義(χ2=7.389,P<0.01)。

圖2 乳腺癌免疫組化p62陰性表達(×100)

圖3 乳腺癌免疫組化p16細胞質強陽性表達(×100)

圖4 乳腺癌免疫組化p16陰性表達(×100)

圖5 乳腺癌免疫組化Ki-67細胞核陽性表達(×100)

圖6 乳腺癌免疫組化Ki-67陰性表達(×100)

2.2p62、p16和Ki-67表達與臨床病理特征的關系 p62陽性表達與組織學分級和淋巴結轉移相關，差異有統計學意義(P<0.05)；p16和Ki-67陽性表達與組織學分級相關，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3p62、p16和Ki-67表達與ER的關系 乳腺癌組p62、p16、Ki-67陽性表達與ER呈顯著負相關(P<0.05)。見表2。

2.4p62、p16和Ki-67相關性分析 乳腺癌組p62和Ki-67表達呈顯著正相關(P<0.01)；p16和Ki-67表達呈顯著正相關(P<0.05)；p62和p16表達無相關性(P>0.05)。見表3。

表1 p62、p16和Ki-67表達與乳腺癌臨床病理特征的關系(n)

表2 p62、p16和Ki-67表達與ER的關系 (n)

表3 乳腺癌中p62、p16和Ki-67的相關性(n)

3 討 論

自噬是一種進化保守、亞細胞水平的自我吞噬，自噬基因的異常表達與一些腫瘤的形成密切相關。自噬相關蛋白p62是一種支架蛋白。自噬發生時，p62首先與細胞質中泛素化蛋白結合，再與定位于自噬體內膜上微管相關蛋白輕鏈3(LC3B)形成復合物，被自噬溶酶體降解。自噬過程中，p62蛋白在細胞質中不斷被降解，自噬被抑制時，p62蛋白在細胞質中不斷積累，因此p62可作為反映自噬活性的標記蛋白〔5〕。本實驗結果顯示，p62蛋白在乳腺癌細胞質中表達明顯高于癌旁正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤，p62在乳腺癌異常聚集表明自噬活性顯著減弱，自身受損、變性或衰老細胞器和大分子物質得不到及時降解，導致活性氧大量產生，使乳腺正常組織DNA損傷，促使正常乳腺組織向癌進一步轉化。

p62蛋白在乳腺癌表達與臨床病理學參數關系的文獻鮮有報道。本實驗顯示，p62蛋白表達與組織學分級及淋巴結轉移相關，表明p62陽性表達與腫瘤的惡性行為相關，其高表達預示乳腺癌惡性程度高，易發生轉移，是預后差的指標。Burdelski等〔6〕使用免疫組化技術檢測了前列腺癌組織中p62的表達，發現其表達與組織學分級及淋巴結轉移有關，其研究結果與本實驗結果相似。

p16抑癌基因控制細胞分裂的原理是在G1卡點中，與細胞周期中Cyclin D1發生競爭，結合并且抑制CDK4活性，從而阻止細胞特別是損傷DNA的細胞進入S期〔7，8〕，其異常表達表現為過表達或表達下調。有研究〔9〕提出p16的過表達在惡性程度高的腫瘤中作用更突出，乳腺癌中可較多出現過表達。亦有文獻報道〔10〕在乳腺癌中會出現p16下調。

本實驗結果顯示，p16蛋白在乳腺癌細胞質中彌漫強陽性表達，明顯高于癌旁正常乳腺組及乳腺良性腫瘤。提示p16高表達可能與乳腺癌發生、發展具有一定的相關性，并且在三陰乳腺癌中高表達，預示p16有可能成為三陰乳腺癌的檢測指標。

本實驗顯示，p16蛋白表達與組織學分級相關，表明p16陽性表達與腫瘤的惡性行為相關，其高表達預示乳腺癌惡性程度高，易發生轉移，是預后差的指標。

Ki-67是一種與細胞增殖密切相關核抗原，是評價惡性腫瘤細胞增殖程度最可靠的指標。本研究結果表明，在乳腺癌組織中Ki-67陽性表達定位于細胞核，與癌旁正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤表達差異顯著，Ki-67與組織學分級顯著相關，因此，在乳腺癌組織中Ki-67的高表達可提示腫瘤細胞增殖活躍，侵襲力強，易發生轉移，預后較差。

p62、Ki-67呈顯著正相關表明兩者共同促進腫瘤發生，在乳腺癌中兩者高表達預示了腫瘤惡性程度高，侵襲力強，易發生轉移；

ER的缺失與p16的異常表達相關，p16的異常表達在低分化的癌組織陽性率高，與ER表達呈負相關，與Ki-67的表達正相關〔11〕，與本研究結果一致，提示p16有可能成為乳腺癌惡性程度及判斷預后有力檢測指標之一。

綜上所述，乳腺癌組織中存在著p62和Ki-67過度表達及p16蛋白異常表達，p62、p16和Ki-67可成為判斷乳腺癌組織分化程度及預后的實驗室指標。