蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵菌絲體和固體栽培子實(shí)體中活性成分的比較

朱麗娜，高新華，劉艷芳，張紅霞，周 帥，張 忠，李傳華，唐慶九*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)，上海201403；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海201403）

蛹蟲(chóng)草［Cordycepsmilitaris（L.）Link］，又稱北蟲(chóng)草、蛹草、北冬蟲(chóng)夏草、蛹草菌等［1］，其含有的多糖、核苷、甾醇等多種活性成分具免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化、抗衰老、抗病毒等作用［2-3］。蛹蟲(chóng)草已實(shí)現(xiàn)人工規(guī)模化種植，并于2009年被批準(zhǔn)為新資源食品，因而蛹蟲(chóng)草子實(shí)體成為保健品、食品的重要原料［4］。

固體培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體是目前蛹蟲(chóng)草人工培植的主要方式，將蛹蟲(chóng)草菌種接種在大米、小麥等固體培養(yǎng)基上，在一定的溫度、濕度和光照條件下，培養(yǎng)45—60 d獲得蛹蟲(chóng)草子實(shí)體［5］。研究表明，深層發(fā)酵菌絲體中存在和子實(shí)體的藥用作用相同的化學(xué)物質(zhì)［6-8］，具有相似的藥理作用［9-12］。以往對(duì)蛹蟲(chóng)草菌液體發(fā)酵的研究主要集中在培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化方面［13-17］，關(guān)于相同蛹蟲(chóng)草菌株用不同培養(yǎng)方式得到的子實(shí)體和菌絲體的活性成分差異還未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬比較同一蛹蟲(chóng)草菌株獲得的子實(shí)體和菌絲體在多糖、核苷、游離糖醇和小分子糖類及氨基酸成分方面的差異，以期為今后不同蛹蟲(chóng)草產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

蛹蟲(chóng)草菌株（編號(hào)CM-H0810）由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所蟲(chóng)草課題組保藏。

1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、海藻糖、赤蘚糖醇、甘露醇為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品（P-82）為日本Shodex公司產(chǎn)品；黃嘌呤、次黃嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胞苷、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、鳥(niǎo)苷、肌苷、胸苷、蟲(chóng)草素（3’-脫氧腺苷）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；2’-脫氧鳥(niǎo)苷和2’-脫氧腺苷購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；N6-（2-羥乙基）腺苷由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所加工技術(shù)與發(fā)酵工程研究室分離純化，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR和ES-MS鑒定；甲醇（色譜純）為美國(guó)Dikma公司產(chǎn)品。

凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光檢測(cè)聯(lián)用系統(tǒng)由Waters 2695高效液相系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）、2414示差折光檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）、DAWN 8+激光檢測(cè)器（美國(guó)Wyatt公司），Waters 2998紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）組成。Waters 1525高效液相色譜儀配Waters 2489紫外檢測(cè)器和Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Waters公司）；ICS-2500型高效離子色譜儀（美國(guó)Dionex公司）；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀（日本Hitachi公司）；KQ-600B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PURELAB ULTRA純水制備儀（英國(guó)Elga公司）。

1.3 蛹蟲(chóng)草的培養(yǎng)

菌種制作：菌株在PDA斜面培養(yǎng)基上活化后，接種于PDB培養(yǎng)基中（50 mL PDB培養(yǎng)基裝于150 mL三角瓶），150 r/min、25℃下培養(yǎng)4 d，獲得所需要的生產(chǎn)菌種。固體培養(yǎng)子實(shí)體：20 g麥仁，33 mL水裝入玻璃培養(yǎng)瓶中（直徑6.8 cm，高10.5 cm），高壓滅菌25 min，冷卻后接種，瓶蓋中墊上濾紙，在保證透氣的同時(shí)避免空氣交換可能引發(fā)的污染，于25℃暗培養(yǎng)3—4 d，當(dāng)觀察到菌絲已明顯在培養(yǎng)基表面開(kāi)始蔓延時(shí)，轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度控制在500 lx左右，培養(yǎng)溫度調(diào)至22℃，培養(yǎng)17 d左右，子實(shí)體原基開(kāi)始出現(xiàn)，45 d左右子實(shí)體成熟并長(zhǎng)滿全瓶時(shí)收獲。

液體發(fā)酵菌絲體：50 mL PDB培養(yǎng)基裝于150 mL三角瓶，接入液體菌種，150 r/min、25℃下培養(yǎng)4 d。過(guò)濾收集菌絲體，用蒸餾水清洗后備用。

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和菌絲體分別于60℃干燥后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，備用。

1.4 多糖測(cè)定

參考文獻(xiàn)［18］的方法提取蛹蟲(chóng)草多糖并測(cè)定多糖含量。參考文獻(xiàn)［19］的方法測(cè)定單糖組成。用凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光檢測(cè)儀聯(lián)用分析多糖的HPSEC圖譜，考察多糖的分子質(zhì)量分布情況［20］。色譜條件：色譜柱為T(mén)SK-GEL G6000PWXL串聯(lián)TSK-GEL G4000PWXL；2414示差折光檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司），DAWN 8+激光檢測(cè)器（美國(guó)Wyatt公司）；流動(dòng)相為0.15 mol/L的NaNO3和0.05 mol/L的NaH2PO4·2H2O（pH 7.0），流速0.5 mol/L，上樣量100μL。用ASTRA 6.1計(jì)算分子質(zhì)量，以5 mg/mL的普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正，多糖在溶液中的折光指數(shù)增量（dn/dc）按照0.146 mL/g計(jì)算。每個(gè)樣品2次重復(fù)。

1.5 核苷類成分測(cè)定

采用高效液相色譜測(cè)定核苷類成分［20］。色譜條件：色譜柱Venusil MP C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）（中國(guó)Agela Technologies公司）；流動(dòng)相：水（A相）-甲醇（B相）；流速：1 mL/min；洗脫程序?yàn)?—5 min：100%A，5—10 min，95%A，10—30 min：70%A，30—40 min：95%A，40—45 min：100%A；UV檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.6 游離糖醇及小分子糖類成分測(cè)定

采用高效陰離子色譜測(cè)定游離糖醇及小分子糖類成分［20］。色譜條件：CarboPac MA1陰離子交換柱（4 mm×250 mm）（美國(guó)Dionex公司），流動(dòng)相為480 mmol/L NaOH，流速0.40 mL/min，上樣量25μL，柱溫30℃。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.7 氨基酸測(cè)定

樣品委托上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心根據(jù)GB/T 5009.124—2003測(cè)定氨基酸組成，氨基酸測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖

表1為相同蛹蟲(chóng)草菌株獲得的子實(shí)體和菌絲體中多糖含量和其單糖組成及摩爾分?jǐn)?shù)。經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定蛹蟲(chóng)草菌絲體中多糖含量比子實(shí)體高25.1%。兩種培養(yǎng)方式得到的子實(shí)體和菌絲體中多糖的單糖組成中均由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，但組成比例有差異，子實(shí)體多糖的單糖組成中葡萄糖所占摩爾分?jǐn)?shù)最高為67.87%，其他單糖所占摩爾分?jǐn)?shù)為2.75%—17.18%，而菌絲體中葡萄糖所占摩爾分?jǐn)?shù)最高為37.87%，其次為甘露糖占33.22%、半乳糖占26.91%。

表1 多糖含量和單糖組成比較Table 1 Com parison of polysaccharide content and monosaccharide com position %

對(duì)多糖的分子質(zhì)量分布圖譜進(jìn)行測(cè)定可以反映不同樣品間的多糖差異。用多角度激光光散射儀測(cè)定聚合物和蛋白質(zhì)等生物高聚物的絕對(duì)分子質(zhì)量，無(wú)需進(jìn)行任何色譜柱標(biāo)定和對(duì)照品參考，分子質(zhì)量測(cè)定范圍廣，可檢測(cè)獲得數(shù)均和重均分子質(zhì)量。對(duì)培養(yǎng)獲得的子實(shí)體和菌絲體中多糖進(jìn)行HPSEC-MALLSRI聯(lián)用分析，其HPSEC圖譜見(jiàn)圖1。根據(jù)HPSEC圖譜上的出峰情況和紫外吸收情況，經(jīng)檢測(cè)0—44 min無(wú)紫外吸收，44 min后在280 nm波長(zhǎng)下有明顯的紫外吸收峰，說(shuō)明44 min后出峰的組分中混有蛋白類物質(zhì)，因此將圖譜上的多糖分為3個(gè)組分，多糖各組分的分子質(zhì)量分布特征見(jiàn)表2，其中蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的多糖主要在Fraction 1和Fraction 2這兩個(gè)組分，其重均分子質(zhì)量Mw為1.702×106—4.092×107g/mol，多分散系數(shù)（Mw/Mn）為1.185—1.619，說(shuō)明這兩個(gè)組分的Mw分布范圍窄，而菌絲體的多糖主要在Fraction 3組分中，其重均分子質(zhì)量為1.105×105g/mol。

圖1 多糖的HPSEC圖譜比較Fig.1 Comparison of high-performance size exclusion chromatography profile of polysaccharides

表2 多糖分子質(zhì)量分布特征的比較Table 2 Comparison ofmolecular characterizations of polysaccharides

2.2 核苷

用HPLC對(duì)核苷類成分進(jìn)行分析，其HPLC圖譜見(jiàn)圖2，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版”軟件分析固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)獲得的子實(shí)體和菌絲體中核苷類成分HPLC圖譜的相似度。結(jié)果表明，子實(shí)體和菌絲體中均含有多種核苷類成分，HPLC圖譜的相似度為0.886。HPLC圖譜表明，固體培養(yǎng)子實(shí)體中尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素及N6-（2-羥乙基）腺苷的峰較高，為主要的核苷類成分，而液體培養(yǎng)菌絲體中主要的核苷類成分是尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素。各核苷類成分含量見(jiàn)表3，子實(shí)體和菌絲體中腺苷含量無(wú)顯著差異，但子實(shí)體中的蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷含量與菌絲體差異顯著。

圖2 核苷類成分HPLC色譜圖比較Fig.2 Comparison of HPLC chromatography profiles of nucleosides

表3 核苷類成分的含量比較Table 3 Com parison of nucleoside contents mg·g-1

2.3 游離糖醇及小分子糖類成分

甘露醇也是蟲(chóng)草類真菌中的有效成分之一，具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、鎮(zhèn)喘祛痰、抗自由基等藥理作用，并且對(duì)多種疾病有一定的療效［22］。研究表明，除甘露醇外，蛹蟲(chóng)草中還含有其他糖醇及游離的單糖、寡糖，它們不僅是有機(jī)體的組成和代謝產(chǎn)物，也是化學(xué)工業(yè)、商業(yè)和醫(yī)藥上的重要物質(zhì)。由表4可知，蛹蟲(chóng)草菌絲體中甘露醇較高，但沒(méi)有海藻糖，而子實(shí)體中海藻糖含量高達(dá)20.07%。

表4 游離糖醇、小分子糖類含量比較Table 4 Comparison of contents of free alditol and low molecular weight sugar %

2.4 氨基酸

由表5可見(jiàn)，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和菌絲體中均含有豐富的氨基酸，與子實(shí)體相比，菌絲體的必需氨基酸總量高17.1%，且必需氨基酸與非必需氨基酸的比值、必需氨基酸與氨基酸總量的比值較為理想，分別為0.62和0.38，接近FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)必需氨基酸（E%）應(yīng)達(dá)總量40%左右以及E/N值應(yīng)在0.6以上的要求［23］。

表5 氨基酸含量比較Table 5 Comparison of am ino acid contents

3 討論

固體培養(yǎng)子實(shí)體比液體深層發(fā)酵經(jīng)歷的生理過(guò)程復(fù)雜，且周期長(zhǎng)。液體發(fā)酵具有發(fā)菌速度快（周期短）、生產(chǎn)效率高并且成本低、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵的液體培養(yǎng)基中會(huì)產(chǎn)生大量具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的菌絲體。雖然目前市場(chǎng)上蛹蟲(chóng)草的產(chǎn)品形式為固體培養(yǎng)得到子實(shí)體，但蛹蟲(chóng)草菌絲體也具有很高的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。本研究比較相同菌株通過(guò)固體培養(yǎng)獲得的子實(shí)體和液體培養(yǎng)獲得的菌絲體之間多糖、核苷、游離糖醇及小分子糖類、氨基酸組成方面的差別，發(fā)現(xiàn)子實(shí)體和菌絲體中這些活性成分有所差異，說(shuō)明子實(shí)體和菌絲體的生物活性也不盡相同，在今后應(yīng)用上也應(yīng)區(qū)別對(duì)待，對(duì)蛹蟲(chóng)草是否可以作為子實(shí)體的替代品仍需做大量的研究工作。蛹蟲(chóng)草菌絲體雖然在多糖含量上高于子實(shí)體，但其單糖組成的摩爾分?jǐn)?shù)及多糖分子質(zhì)量分布不同。由于多糖的活性與其結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量有密切關(guān)系［23-24］，因此需要對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和菌絲體中的多糖進(jìn)一步分離純化并對(duì)其生物活性進(jìn)行研究，為今后蛹蟲(chóng)草多糖產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。蛹蟲(chóng)草子實(shí)體或發(fā)酵菌絲中核苷類化合物種類較多，蟲(chóng)草素是蟲(chóng)草屬真菌中特有成分，該成分具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［25］，是蛹蟲(chóng)草中發(fā)揮藥理作用的主要活性成分之一。除蟲(chóng)草素外，蛹蟲(chóng)草中的另一種核苷類成分N6-（2-羥乙基）-腺苷，具有較好的鎮(zhèn)痛、Ca2+拮抗、抗腫瘤作用［26-27］，它在蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中的含量也較高，但在菌絲體中的含量很低，因此如果今后針對(duì)蛹蟲(chóng)草中N6-（2-羥乙基）-腺苷這一成分進(jìn)行分離純化和活性研究應(yīng)選擇蛹蟲(chóng)草子實(shí)體為原料。海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過(guò)程和生物特征。這一獨(dú)特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質(zhì)藥物、酶、疫苗和其他生物制品的優(yōu)良活性保護(hù)劑以外，還是保持細(xì)胞活性、保濕類化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風(fēng)味、提升食品品質(zhì)的獨(dú)特食品配料［28］。蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中海藻糖含量高達(dá)20.07%，這為蛹蟲(chóng)草開(kāi)發(fā)相關(guān)功能產(chǎn)品提供了有利的物質(zhì)基礎(chǔ)，而蛹蟲(chóng)草發(fā)酵菌絲體中游離糖醇組成和子實(shí)體不同，且其中甘露醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于子實(shí)體中的，這其中的代謝轉(zhuǎn)化都值得深入研究。此外，本研究中對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和菌絲體多糖的HPSEC圖譜、核苷類成分HPLC圖譜和游離糖醇小分子糖類成分的分析結(jié)果也可為今后蛹蟲(chóng)草兩種不同產(chǎn)品形式的辨別提供一定的科學(xué)依據(jù)。