玉米赤霉烯酮對蛋雞生產性能、血液指標和生殖激素水平的影響

凌阿茹，郭晉麗*，郭文博，楊俊花**，趙志輝

（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海201403）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是禾谷鐮刀菌在適宜的溫度和濕度條件下產生的一種真菌毒素，廣泛存在于霉變的玉米、小麥和高粱等谷類作物中［1］。大量研究證實，ZEA及其代謝物能夠引起畜禽真菌毒素中毒［2］，影響內臟器官發育［3］，還可導致動物繁殖障礙［4］、消化系統功能紊亂［5］，給養殖業造成極大危害。已有研究發現，ZEA與內源性雌激素在結構上相似，可通過與雌激素受體（Estrogen receptor，ER）的競爭性結合，發生一系列擬雌激素效應［6-7］，產生毒性。此外，ZEA與ER結合生成的化合物會轉移至胞核內，調節基因轉錄和蛋白質合成，進一步影響細胞分裂和生長［8］。

蛋雞作為養殖業的重要組成部分，每年因真菌毒素污染造成的經濟損失不容忽視。目前，國內外關于ZEA單一毒素污染對蛋雞毒性作用的研究報道非常少。Borutova等［9］通過給肉雞飼喂3.44 mg/kg DON（Deoxynivalend）和3.36 mg/kg ZEA混合污染的飼料，發現混合毒素可以誘導肉雞氧化應激進而影響免疫功能；伍宇超等［10］研究發現，低劑量的ZEA并不會影響育成期蛋雞的生長性能，但會顯著影響其血清生化指標和抗氧化指標。然而，目前關于ZEA對蛋雞的生產性能、毒性作用、安全閾值等仍沒有明確定論。

本試驗選用ZEA標準品，采用直接灌胃的方式研究不同劑量ZEA處理對蛋雞生產性能、蛋品質、血常規指標、血液生化指標和生殖激素水平的影響，觀察ZEA對蛋雞的臨床毒性效應，探究蛋雞對ZEA的安全劑量范圍，旨在為真菌毒素毒理學研究提供有價值的理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ZEA標準品：淺褐色粉末，純度≥99%，Pribolab，新加坡，（北京普華仁生物技術開發有限公司）；乙醇、乙腈：色譜純，（Merck，美國）；氯化鈉（上海埃彼化學試劑有限公司）；血清生殖激素ELISA試劑盒（上海潤裕生物科技有限公司）。

標準品先用乙醇∶乙腈（4∶1，v∶v）溶解，后用生理鹽水稀釋，其中乙醇∶乙腈的終體積濃度控制在1%以下。

EMT-7300型多功能蛋品分析儀（Robotmation，日本）；EFG-0503型蛋殼強度測定儀（Robotmation，日本）；Sorvall ST-16R型高速冷凍離心機（Thermo Fisher，美國）；HB型全自動血細胞分析儀（英諾華，中國）；Au-5800型全自動血液生化分析儀（Beckman，美國）；Infinite M-200型多功能酶標儀（Tecan，瑞士）。

1.2 飼養管理與試驗設計

隨機選取同一批次、同一品種、體況良好、產蛋率一致的34周齡海蘭蛋雞100只，隨機分為5組，每組設4個重復，每個重復5只，于2017年10月10日至11月21日在上海市農業科學院畜牧獸醫研究所動物房進行飼養。采用直接灌胃的方式，對照組灌胃等量生理鹽水，試驗組分別灌胃0.5 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg ZEA（飼糧，每只雞按每天150 mg飼糧飼喂），預飼期2周，試驗期4周，試驗期間連續灌服ZEA，每天下午產蛋結束后進行。選用3層階梯籠養，每籠1只，按照封閉式蛋雞養殖場規定飼養，保證每天充足光照16 h，室溫范圍16—20℃，濕度50%—60%。每日6：00喂料1次，自由采食、飲水。蛋雞飼喂基礎飼糧（表1）參照雞的飼養標準（NY/T 33—2004）并結合羅愛瓊等［11］的方法配制。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）Table 1 Composition and nutrient levels in basal diet（air dry basis） %

1.3 樣品采集與檢測

1.3.1 生產性能

每天詳細記錄各組的產蛋數、軟破殼蛋數、蛋重、采食量和死亡雞只數，每周測雞體重，計算整個試驗期不同組的平均蛋重、產蛋率、采食量、料蛋比。計算公式如下：

平均蛋重（g）=平均每日總蛋重/總蛋數；

產蛋率=平均每日總蛋數/雞數×100%；

采食量（g/d）=每日消耗飼糧總量/雞數；

料蛋比=采食量/產蛋重。

1.3.2 蛋品質測定

試驗結束前3 d（2017年11月19—21日），連續收集各試驗組雞蛋，每組隨機選取30枚雞蛋用多功能蛋品分析儀和蛋殼強度測定儀檢測以下指標：蛋形指數、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈氏單位、蛋黃顏色、蛋殼顏色等。

1.3.3 血常規指標測定

試驗結束時（2017年11月21日），每只雞用真空管翅靜脈采血5 mL。其中，1 mL由加肝素鈉抗凝劑的真空管收集，30 min內用全自動血細胞分析儀測定血常規指標：白細胞總數（WBC）、淋巴細胞總數（LY）、單核細胞數（MO）、中性粒細胞數（GR）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、紅細胞總數（RBC）、紅細胞平均體積（MCV）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板總數（PLT）；4 mL由不含抗凝劑的真空管收集，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，-20℃冷凍保存，用于血液生化指標分析及激素水平測定。

1.3.4 臟器系數

采血結束后，每個試驗組每個重復隨機選取3只雞，共60只進行宰殺，手術分離心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢和子宮等器官，準確稱重并根據如下公式計算：

臟器系數=臟器重量（g）/動物體重（g）×100%。

1.3.5 血液生化指標測定

用全自動血液生化分析儀對以下指標進行測定：白蛋白（ALB）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、尿素（UREA）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBILI）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、總蛋白（TP）、肌酐（CRE）、球蛋白（GLB）。

1.3.6 血清生殖激素水平分析

多功能酶標儀對血清中以下激素水平進行測定：促黃體素（Luteinizing hormone，LH）、卵黃蛋白原（Vitellogenin，VTG）、孕酮（Progesterone，P4）、β內啡肽（β-endorphin，β-EP）、雌二醇（Estradiol，E2）、生長激素（Growth hormone，GH）和促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，FSH）。

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。差異顯著性檢驗采用單因素方差分析（One-way ANOVA，LSD），其中P＜0.05為差異顯著、P＜0.01為差異極顯著，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 ZEA對蛋雞生產性能的影響

由表2可見，各試驗組蛋雞體重均未見顯著變化。與對照組相比，只有5 mg/kg組產蛋率顯著提高，且顯著高于其他各組（P＜0.01）；同時50 mg/kg組的產蛋率還顯著低于0.5 mg/kg組（P＜0.05）。此外，5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組的采食量均顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），200 mg/kg組還顯著高于0.5 mg/kg組（P＜0.05）。與對照組相比，0.5 mg/kg、5 mg/kg和50 mg/kg組平均蛋重顯著提高（P＜0.05或P＜0.01），200 mg/kg組卻顯著降低（P＜0.01）；與0.5 mg/kg組相比，5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組平均蛋重均極顯著降低，且呈劑量效應關系（P＜0.01）。與對照組相比，0.5 mg/kg組料蛋比無顯著變化（P＞0.05），5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組均顯著提高（P＜0.05或P＜0.01），其中200 mg/kg組料蛋比顯著高于5 mg/kg和50 mg/kg組（P＜0.05）。

表2 不同劑量ZEA對蛋雞生產性能的影響Table 2 Effects of ZEA with different doses on laying performance in laying hens

2.2 ZEA對蛋品質的影響

由表3可見，各試驗組蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈氏單位均未見顯著變化。與對照組相比，0.5 mg/kg、5 mg/kg和50 mg/kg組蛋形指數均無顯著變化，只有200 mg/kg組顯著提高（P＜0.05）；0.5 mg/kg和50 mg/kg組蛋黃顏色顯著降低，而5 mg/kg和200 mg/kg組無顯著變化。0.5 mg/kg組蛋殼顏色較對照組顯著降低（P＜0.05），其余各組均無顯著變化，而與0.5mg/kg組相比，50mg/kg組蛋殼顏色顯著提高（P＜0.05）。

表3 不同劑量ZEA對蛋品質的影響Table 3 Effects of ZEA with different doses on egg quality

2.3 ZEA對蛋雞各組織臟器系數的影響

由表4可見，各試驗組心、肝、脾、肺和子宮的臟器系數均無顯著差異。與對照組相比，50 mg/kg和200 mg/kg組腎臟系數顯著提高（P＜0.05）。隨著ZEA灌胃劑量的增加，卵巢系數有降低趨勢，但在統計學上無顯著差異，只有200 mg/kg組顯著低于對照組（P＜0.05）。

表4 不同劑量ZEA對蛋雞各組織臟器系數的影響Table4 Effects of ZEA with different doses on organ indexes in laying hens %

2.4 ZEA對蛋雞血常規指標的影響

由表5可見，各試驗組HGB、HCT、RBC、MCV、MCHC和PLT均未見顯著變化。與對照組相比，0.5 mg/kg組WBC和LY數量均無顯著變化，5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組的WBC和LY數量均顯著增加（P＜0.01），且呈劑量-效應關系；同時，50 mg/kg和200 mg/kg組WBC和LY數量顯著高于5 mg/kg組（P＜0.01）。隨著ZEA灌胃劑量的增加，MO和GR數量逐漸增加，也呈劑量-效應關系，其中50 mg/kg和200 mg/kg組均顯著高于對照組（P＜0.01）。

表5 不同劑量ZEA對蛋雞血常規的影響Table 5 Effects of ZEA w ith different doses on hematological indices in laying hens

2.5 ZEA對蛋雞血液生化指標的影響

由表6可見，各試驗組除了UREA和CRE外，其他生化指標均未呈現顯著差異。與對照組相比，0.5 mg/kg組UREA濃度無顯著變化，5 mg/kg和50 mg/kg組顯著升高（P＜0.05），200 mg/kg組極顯著升高（P＜0.01）。隨著ZEA灌胃劑量的增加，CRE濃度有上升的趨勢，與對照組相比，只有50 mg/kg和200 mg/kg組CRE濃度顯著升高（P＜0.05）。

表6 不同劑量ZEA對蛋雞血液生化指標的影響Table 6 Effects of ZEA w ith different doses on serum biochem ical parameter in laying hens

2.6 ZEA對蛋雞血液生殖激素水平的影響

由表7可見，各試驗組血清中VTG、E2、GH和FSH水平均無顯著差異。與對照組相比，0.5 mg/kg組LH和P4水平均無顯著變化，5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組LH水平均顯著降低（P＜0.01），P4水平均顯著提高（P＜0.05），呈現劑量-效應關系。此外，0.5 mg/kg和5 mg/kg組β-EP水平無顯著變化（P＞0.05），50 mg/kg和200 mg/kg組較對照組顯著提高（P＜0.05或P＜0.01），且200 mg/kg組顯著高于50 mg/kg組（P＜0.01）。

表7 不同劑量ZEA對蛋雞血液生殖激素水平的影響Table 7 Effects of ZEA w ith different doses on reproductive hormone levels in laying hens

3 討論

3.1 ZEA對蛋雞生產性能的影響

Jia等［12］研究發現，ZEA污染量為0.2602 mg/kg的日糧對蛋雞產蛋量和采食量均無顯著影響。本試驗中，當ZEA劑量不高于0.5 mg/kg時，與對照組相比產蛋率和采食量均無顯著變化，與Jia等［12］研究結果一致。當ZEA劑量達到5 mg/kg時，產蛋率、采食量和料蛋比較對照組均顯著提高，表明低劑量的ZEA能夠提高蛋雞產蛋性能。有研究顯示，禽類的產蛋性能與卵巢卵泡的生長發育密切相關［13］，筆者推測ZEA作為一種類雌激素，當劑量為5 mg/kg時可促進蛋雞性腺和卵泡發育，進而提高蛋雞的產蛋率，但其作用機制仍需進一步深入探究。本研究中，0.5 mg/kg的ZEA可以使蛋重顯著提高，當ZEA劑量達到200 mg/kg時，蛋重顯著降低，表明高劑量的ZEA會產生過雌激素毒性作用，對卵巢造成損傷，降低蛋雞產蛋性能，有研究發現，ZEA會抑制肉雞、豬、狗和大鼠等雌性動物的卵巢發育［14-17］。

3.2 ZEA對蛋品質的影響

蛋品質作為評價雞種優劣的重要指標，本試驗中，對照組蛋形指數在正常值范圍內，200 mg/kg組較對照組顯著提高，這可能與高劑量的ZEA影響蛋雞生殖功能和器官發育有關。ZEA與雌激素受體結合表現出弱雌激素活性，會造成動物體內生殖激素紊亂，生殖器官損傷，對動物繁殖機能造成嚴重的影響［15］。有研究顯示，蛋殼顏色不僅與遺傳有關，還與殼上膜的量及其中所含色素的量有關，殼上膜是蛋殼的最外層，母雞殼上膜的分泌量不隨年齡的變化而提高，但在蛋重增大時，有限的殼上膜分布不到擴大的蛋殼上，因此蛋殼顏色變淺［18］。在本研究中，與對照組相比，只有0.5 mg/kg組蛋殼顏色顯著降低，因此推測與其蛋重顯著提高有關。另外，與對照組相比，0.5 mg/kg和50 mg/kg組蛋黃顏色顯著降低，這可能與ZEA影響卵泡發育，導致色素沉積不充分有關。因為色素沉積會隨卵巢中卵泡的發育而增強，而卵泡發育通常需要5—10 d，因此蛋黃完全著色需要5—10 d［13］，推測在此過程中ZEA破壞蛋雞的生殖發育系統，影響了卵泡發育，進而影響色素沉積最終導致蛋黃顏色變淺，但其作用機制有待進一步深入研究。

3.3 ZEA對蛋雞各組織臟器系數的影響

臟器系數能夠直觀地反映不同濃度外源性有毒有害物質作用后的蛋雞內臟器官生長發育或病變情況。臟器系數增大，提示臟器充血、水腫或增生肥大等變化；臟器系數減小，提示臟器萎縮及其他退行性疾病。Salem等［19］研究發現，40mg/kg b.w.的ZEA可使小鼠腎臟細胞發生氧化應激反應，誘導細胞死亡，從而對腎臟產生毒性作用。本研究中，隨著ZEA灌胃劑量的增加，各試驗組的腎臟臟器系數逐漸增加，呈劑量-效應關系，當ZEA灌胃劑量高于50 mg/kg，腎臟臟器系數較對照組均顯著提高，表明ZEA灌胃劑量高于50 mg/kg時，會誘導腎臟水腫充血，增生肥大，對腎臟造成明顯損傷。Jia等［20］研究發現，給妊娠母豬飼喂被ZEA污染的飼糧后，腎臟發生腫大，與本試驗結果一致。當ZEA灌胃劑量達到200 mg/kg時，卵巢臟器系數顯著降低，表明200 mg/kg的ZEA會使蛋雞卵巢萎縮，造成損傷，進一步證明了高劑量ZEA對蛋雞卵巢的損傷作用。Zwierzchowski等［21］也發現，0.2 mg/kg.b.w.的ZEA處理母豬后，會抑制其卵巢卵泡的生長發育，提示與ZEA誘導卵巢顆粒細胞發生凋亡有關。這些毒性作用，一方面與ZEA發揮類雌激素作用，與細胞質雌激素受體結合、進入細胞核導致染色體異常，抑制DNA和蛋白質合成有關，另一方面與ZEA誘導細胞氧化損傷進而發生凋亡相關［22］。

3.4 ZEA對蛋雞血常規指標的影響

伍宇超等［10］通過在育成期蛋雞基礎日糧中添加0.4 mg/kg的ZEA發現，蛋雞血液中性粒細胞數顯著提高；Maaroufi等［23］發現，給雌性大鼠腹膜注射1.5—5.0 mg/kg的ZEA，48 h后大鼠血液白細胞數量顯著提高。本研究也發現當ZEA灌胃劑量高于5 mg/kg時，蛋雞血液中WBC、LY和GR數量均顯著提高；當劑量高于50 mg/kg時，MO數量顯著提高，可見當ZEA高于5 mg/kg時可誘導蛋雞發生嚴重的炎癥反應。

3.5 ZEA對蛋雞血液生化指標的影響

尿素（UREA）和肌酐（CRE）水平是體現腎臟腎小球的濾過功能的重要指標，當腎臟受損時會引起UREA和CRE濃度升高。本試驗中，當ZEA灌胃劑量高于50mg/kg時，血清中UREA和CRE濃度較對照組均顯著提高，表明ZEA濃度在高于50 mg/kg時會嚴重損傷蛋雞腎臟。孫真真等［24］給蛋雞灌胃ZEA后也發現血清中UREA和CRE濃度顯著提高，與本研究結果一致，進一步證明腎臟是ZEA毒性作用的另一靶標器官。

3.6 ZEA對蛋雞血清生殖激素水平的影響

研究顯示，創傷后血漿內β-EP水平升高，推測β-EP水平也是反應創傷早期炎癥變化的重要標志物之一［25］。本試驗中，當ZEA灌胃劑量高于5 mg/kg時，與對照組相比β-EP水平顯著提高，進一步表明ZEA誘導機體發生了嚴重的炎癥反應。促黃體素（LH）能誘導排卵前的卵泡生長發育并觸發排卵，促進黃體形成同時分泌孕酮（P4）。在本研究中隨著ZEA灌胃劑量的增加，LH水平逐漸降低，且呈劑量-效應關系。當ZEA劑量高于5mg/kg時，與對照組相比各試驗組LH水平均極顯著降低，這可能與ZEA的類雌激素作用有關，由于雌激素對下丘腦和垂體發揮負反饋調節作用，當ZEA進入蛋雞體內后代替雌激素發揮作用，誘導垂體促性腺激素分泌水平降低，進一步導致LH水平降低。而P4水平的極顯著提高，進一步證明了ZEA是通過持續發揮類雌激素作用來誘導P4分泌水平提高的。

4 結論

①當ZEA劑量高于5 mg/kg時，會降低平均蛋重、增加料蛋比，影響蛋雞的生產性能，同時對蛋殼和蛋黃顏色沉積也有一定的干擾作用。

②ZEA灌胃劑量高于5 mg/kg時，蛋雞血液中WBC、LY、GR、MO數量及內分泌激素β-EP水平均顯著提高，表明ZEA誘導蛋雞產生嚴重的炎癥反應。

③高劑量ZEA灌胃導致蛋雞腎臟水腫充血、臟器系數顯著提高，血液UREA和CRE含量提高，提示腎臟是ZEA對蛋雞毒性作用的另一靶標器官。

④高劑量的ZEA不僅誘導蛋雞卵巢萎縮，而且會干擾性激素β-EP、LH、P4等的分泌。