7個箭筈豌豆品種生育期、產量與SSR遺傳多樣性比較

陳柳倩，路 璐，羅 璇，江 舟，魏臻武，趙文明，陳國宏，徐 琪

（揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009）

為更好地實施“藏糧于地、藏糧于技”戰略，華東地區多處稻-麥田塊采用輪作休耕制度，復種綠肥，以促進生態環境改善和資源永續利用。箭筈豌豆（Vicia sativa L.）是野豌豆屬（Vicia）重要的綠肥之一，不僅能夠顯著提高耕地中有機質含量，還能增加土壤微生物含量和活性，改善各項理化性質，調節土壤養分庫。根據中國數字植物標本館（http：//www.cvh.org.cn/cms/）和宋敏等［1］的統計結果，野豌豆屬植物廣布于我國各省，其中栽培種5種，野生種36種。不同品種的箭筈豌豆生育期和農藝性狀差異明顯，楊紅燕［2］研究發現，不同品種箭筈豌豆（‘蘇箭4號’‘西牧333’‘淮箭1號’）進入花期時間不同，‘蘇箭4號’進入花期最早。

微衛星又稱簡單重復序列（SSRs），一般為短的重復序列（1—6 bp）組成的串聯DNA序列，是繼RFLP、RAPD等分子標記后出現的第二代分子標記技術［3］。隨著分子生物學的發展，微衛星標記技術越來越廣泛地應用于植物遺傳多樣性研究中。Liu等［4］通過轉錄組測序，獲得了1 071條潛在的EST-SSR標記。國外也有學者利用SSR技術分析了窄葉野豌豆和苕子的多樣性，發現這2種箭筈豌豆具有較高的遺傳多樣性，多態信息含量（PIC）達到了0.5以上［5-6］。

箭筈豌豆品種眾多，遺傳多樣性也較豐富，不同品種間農藝性狀差異較大，生產中普遍存在品種雜亂、利用價值難以得到充分發揮的問題。因此，加強箭筈豌豆品種資源研究、篩選優良品種，是發展綠肥生產的基礎和當務之急。本研究以生產中常見的7個箭筈豌豆品種為試驗材料，比較不同品種的生育期和鮮草產量，并利用微衛星標記評價鑒定這7個品種的遺傳多樣性以及親緣關系，旨在篩選優質種質資源，為本地區發展冬季休耕綠肥生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在揚州大學草業科學試驗基地進行，地處江蘇省中部，位于長江北岸、江淮平原南端，為亞熱帶季風性濕潤氣候向溫帶季風氣候的過渡區。該地區年降水量864 mm，平均氣溫15.8℃，無霜期138 d。試驗地土壤為輕壤土，容重1.48 g/cm3，土壤有機質14.58 g/kg，pH 8.46，全氮0.821 g/kg，速效鉀57 mg/kg，有效磷5.36 mg/kg。本研究所用材料均為該地區使用較為廣泛的箭筈豌豆品種（‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘蘭箭3號’‘青箭’‘貴苕’‘連苕’和‘鎮江野豌豆’），均由揚州大學草業科學魏臻武教授實驗室提供。

1.2 生育期和鮮草產量測定

供試7個箭筈豌豆品種于2018年9月20日播種，每個品種種植2個小區，共14個小區，記錄生育進程（出苗期、分枝期、現蕾期、盛花期和結莢期）。盛花期后，采用樣方取樣，樣方面積為1 m2（1 m×1 m），每個小區取3個樣方，取樣后稱鮮草質量，并折算為公頃產量。

1.3 SSR分型分析

1.3.1 基因組DNA提取

每個品種隨機選取混合種子20份，取種子約200 mg，加入液氮充分研磨后將粉末轉移至裂解液中，于60℃水浴20—30 min，期間上下混勻3—5次，加入苯酚-氯仿（1∶1）抽提，去除種子中淀粉等大分子物質，離心吸取上層水相，具體方法按照試劑盒（TIANGEN，北京）說明書進行。NanoDrop ND-1000濃度測定儀測定DNA質量濃度并稀釋至50 ng/μL，于4℃保存。

1.3.2 SSR引物設計及篩選

參照文獻［4］，選取10對具有代表性的引物（表1），由南京擎科生物科技有限公司合成。將7個箭筈豌豆品種的基因組DNA分別混合后進行PCR擴增，擴增結果通過瓊脂糖凝膠電泳進行確認，選取擴增片段呈多態、片段長度在100—500 bp且條帶清晰的引物加入FAM熒光標記修飾進行后續試驗。

表1 SSR引物序列Table 1 The primers of SSR in the experiment

1.3.3 SSR片段擴增與分型

以7個箭筈豌豆品種的20個樣本DNA為模板，分別與篩選出的引物進行PCR擴增，優化后的PCR程序為：94℃預變性3 min；94℃變性35 s，53—56℃退火35 s，72℃延伸13 s，35個循環；72℃延伸7 min，擴增產物以ABI 3730XL DNA全自動基因分析儀為平臺，以GeneScan-500為標準，進行熒光-多重PCR檢測。

1.4 統計分析

試驗采用Excel 2003建立數據庫，利用Microsatellite-Toolkit統計各微衛星位點的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Exp Ne）、雜合度（Ho、He）和多態信息含量（PIC）；并采用UPGMA聚類方法，以遺傳距離為依據構建分析7個箭筈豌豆品種間的遺傳關系。

2 結果與分析

2.1 不同品種箭筈豌豆生育期和鮮草產量的比較

由圖1可以看出，除‘青箭’生育期長達229 d外，其他6個箭筈豌豆品種的生育期均為175 d左右，主要差異在現蕾期和盛花期。從鮮草產量來看（圖2），‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘蘭箭3號’‘青箭’‘貴苕’均超過了250 t/hm2。

圖1 不同品種箭筈豌豆生育期的比較Fig.1 Com parison of grow th period of different Vicia sativa L.varieties

圖2 不同品種箭筈豌豆鮮草產量的比較Fig.2 Com parison of fresh grass yield of different Vicia sativa L.varieties

2.2 不同品種箭筈豌豆遺傳多樣性分析

不同箭筈豌豆品種熒光-多重PCR檢測結果表明，選取的擴增片段具有多態性（圖3）。由表2可知，7個箭筈豌豆品種等位基因數均較為豐富，其中‘連苕’多達30種；‘蘭箭3號’‘鎮江野豌豆’與‘連苕’的PIC分別為0.427、0.377和0.313，其余4個品種呈現低度多態（PIC＜0.25）；‘蘭箭3號’群體雜合度也較高（He＞0.5）。

圖3 熒光-多重PCR檢測結果Fig.3 Results of fluorescent-multip lex PCR

表2 7個箭筈豌豆品種遺傳多樣性參數Table 2 Genetic diversity parameters of 7 Vicia sativa L.varieties

2.3 不同箭筈豌豆品種聚類分析

采用UPGMA聚類方法，基于品種間的遺傳距離，構建不同品種的系統發生樹。如圖4所示，7個品種分為兩個類群，‘連苕’‘鎮江野豌豆’和‘青箭’聚為一類；‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘貴苕’和‘蘭箭3號’聚為一類。

3 討論

不同綠肥作物在相同生長條件下，其生長特性、最適宜翻壓時期并不同。本試驗研究了7個箭筈豌豆品種的生育進程和鮮草產量，結果表明：在本試驗條件下，除‘青箭’生育期較長外，其他6個箭筈豌豆品種的生育期均為175 d左右。由于‘青箭’現蕾期和盛花期時間較長，勢必延長種植‘青箭’適宜翻壓時期，影響下一季水稻種植，因此‘青箭’不適宜本地區推廣種植。綠肥生物量越多，翻埋后越有利于培肥地力［7］。從鮮草產量來看，‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘蘭箭3號’‘青箭’‘貴苕’均超過了250 t/hm2。前人研究表明，春箭筈豌豆5-1-5品系苗期生長緩慢，鮮草產量只有114.7 t/hm2［8］，‘隴箭1號’兩年平均產量只有96.6 t/hm2，可見‘蘭箭3號’等幾個品種具有較高的生物量，意味著翻耕后具有較好的培肥地力。

遺傳多樣性分析表明，7個箭筈豌豆品種均檢測出較多的等位基因數。但從PIC來看，僅有‘蘭箭3號’‘連苕’與‘鎮江野豌豆’為中度多態的品種（0.25＜PIC＜1.00），其余4個品種呈現低度多態（PIC＜0.25），表明野豌豆屬不同品種的PIC存在一定差異，當然也不排除是由于檢測引物不同所致。‘蘭箭3號’群體He較高（＞0.5），說明該品種具有豐富的遺傳多樣性。研究還發現，‘蘭箭1號’‘蘭箭2號’‘蘭箭3號’和‘貴苕’聚為一類。

綜上，‘蘭箭3號’具有合適的生育期、較高的產量和遺傳多樣性，可作為本地區冬季休耕綠肥生產的理想品種。

圖4 基于遺傳距離構建的7個箭筈豌豆品種聚類圖Fig.4 Clustering diagram of 7 Vicia sativa L.varieties based on genetic distance