HPV16基因組甲基化對宮頸病變的影響

吳 思，孫崢嶸

(中國醫科大學附屬盛京醫院生物樣本庫，沈陽 110004)

宮頸癌位居全球女性癌癥相關死亡誘因的第四位，也是發展中國家第二大常見癌癥[1-2]。臨床及流行病學相關研究表明，宮頸癌的發生發展與持續感染高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)有關，以HPV16亞型最常見，約50%的宮頸癌前病變與HPV16相關[3]。目前，尚無有效的宮頸癌治療手段，因此，對宮頸癌的發生發展機制的進一步研究十分重要。持續感染高危型HPV16會導致一系列癌前病變，最終導致宮頸癌發生。HPV16通過調控宿主細胞基因組的遺傳和表觀遺傳影響宿主細胞的正常生理狀況，進而誘發癌變[4]。部分女性接觸高危型HPV16后，僅成為HPV攜帶者，表現為一過性感染，而不發展為宮頸癌。因此，不能將HPV16全基因組DNA檢測作為臨床診斷宮頸癌的檢測指標，需要繼續尋找特異性更高的檢測指標[5]。

DNA甲基化是修飾DNA的一種方式，不改變基因組DNA，僅改變表觀遺傳表現，是細胞維持基因穩定和調節基因表達的主要因素[6]。宮頸癌等疾病患者的癌細胞DNA甲基化發生異常改變，表明DNA甲基化可能與癌癥的發生密切相關[7-9]。現對HPV16 DNA甲基化對宮頸癌發生發展的影響予以綜述，探討其潛在分子機制及遺傳學改變，旨對宮頸癌預防及治療提供新的思路。

1 HPV16 DNA甲基化與宮頸上皮內瘤變

HPV、乙型肝炎病毒等腫瘤相關DNA病毒的DNA甲基化與病毒基因表達、免疫應答以及致腫瘤性等病毒生物學行為相關[10-11]。與真核細胞DNA甲基化作用類似，病毒DNA甲基化可調控病毒復制及轉錄，進而影響病毒的遺傳表現。DNA甲基化指在DNA甲基轉移酶的作用下，胞嘧啶環的第5位加入一個甲基基團，從而形成5-甲基胞嘧啶的過程。5-甲基胞嘧啶主要位于緊鄰鳥嘌呤上游的DNA序列中，可形成甲基化CpG二核苷酸。當宮頸組織細胞發生瘤變時，細胞基因組甲基化模式紊亂，表現出全部或特定基因組甲基化的改變，其中，CpG位點的DNA甲基化主要影響基因的表達。研究表明，DNA甲基化與細胞異常增生有關，可導致腫瘤的發生發展，且CpG的甲基化水平可作為定量分類器準確區分重度宮頸上皮內瘤變和宮頸原位癌[12]。HPV基因組中沒有經典的CpG位點，但存在高密度CpG區域，且特定的高甲基化E1 CpG可能增加了HPV16陽性重度宮頸上皮內瘤變進展為宮頸原位癌的可能性，可見HPV不同區域CpG位點的甲基化具有重要的生物學意義[13]。 HPV可利用宿主細胞器進行轉錄和復制，其生命周期與宿主細胞的分化密切相關。在W12E細胞系中進行的HPV16基因組的CpG甲基化分析表現出一種新的甲基化模式，即E2反應性轉錄模板中的CpG二核苷酸的全部胞嘧啶甲基化或E2蛋白結合位點中的CpG二核苷酸的特異性胞嘧啶甲基化，且此模式的甲基化可以抑制HPV16 E2蛋白的轉錄激活[14]。研究認為，病毒可能利用宿主細胞某種保護性機制使病毒逃避宿主免疫的識別，并維持感染，此機制包括宿主將正鏈病毒DNA作為異源DNA，并通過靶向病毒DNA的外部修飾抑制基因轉錄，或病毒可能通過恢復人甲基轉移酶的外部修飾和(或)組蛋白去乙酰酶對染色質的重塑而策略性地調控病毒自身基因表達[4]。病毒整合廢除了抑制致癌基因E6和E7表達的E2基因，導致感染上皮細胞的廣泛增殖和惡性轉化。宮頸癌E6和E7區域中免疫刺激性CpG基序內的病毒DNA甲基化的過度表達提示，HPV16在此類CpG基序的宮頸癌發病機制中起免疫逃避作用[15]。采用焦磷酸測序法測量HPV DNA甲基化的研究表明，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33和HPV45的L1/L2區域基因的高甲基化與宮頸癌發生相關[16]。HPV基因組中，高水平CpG甲基化與宮頸癌前病變相關，尤其是HPV衣殼L1和L2基因中的甲基化水平[17]。Chaiwongkot等[18]的研究證明，HPV可誘導轉化感染過程中的L1基因的甲基化，并可作為預測宮頸癌快速進展的潛在生物標志物。

流行病學和臨床研究中的HPV甲基化主要集中在HPV16型。HPV16基因結構是雙鏈環狀DNA，長度約為8 000 bp，分子量為5×106，包含長調控區(long control region，LCR)、早期區(E1、E2、E4、E5、E6、E7區)和晚期區(L1、L2區)。LCR是病毒的主要調控區，有多個調控元件(如啟動子、增強子及多種細胞轉錄因子)的結合位點，可對病毒基因的復制、轉錄進行調節，見圖1。既往研究顯示，HPV16型LCR的甲基化程度與宮頸上皮內瘤變2/3的發生風險增加相關，但目前相關研究結果仍不一致[19-25]。有研究證明，感染HPV16受試者基因的甲基化程度可隨宮頸組織病理分級的升高而增加，并經常觀察到浸潤性宮頸癌患者宮頸病變組織的高甲基化，表明基因高甲基化可能降低蛋白質的表達，并參與宮頸癌的發生[20]。另有研究發現，宮頸癌患者存在最高比例的LCR CpG甲基化，無癥狀感染HPV者的甲基化水平次之，宮頸上皮內瘤變患者LCR的甲基化比例最低[21]。Mirabello等[22]通過評估HPV16 L1基因的焦磷酸測序和特定CpG的甲基化水平發現，甲基化水平升高可增加HPV16陽性人群發生宮頸癌的風險。但也有研究認為，隨著宮頸病變的進展，LCR CpG甲基化的比例呈下降趨勢；或LCR或LCR中E2結合位點的CpG甲基化程度與宮頸病變嚴重程度呈負相關[23]。上述研究觀察結果不一致的原因尚未完全明確，可能與甲基化檢測技術(通常不足以檢測低豐度的DNA甲基化)的差異和/或樣本量較小有關。

LCR：長調控區；5′LCR：長調控區基因5′端；Central：中央區；3′LCR：長調控區基因3′端；Enhancer：增強子；Promoter：啟動子；Repl Orig：復制起始點

圖1 HPV16基因組LCR區15個CpG位點圖

2 HPV16 DNA甲基化與病毒轉錄的相關性

甲基化相關的HPV16轉錄沉默的數據主要來源于體外研究。研究顯示，HPV16 LCR的CpG二核苷酸在SiHa細胞中處于非甲基化狀態，但在被轉錄激活的僅有一個或極少數拷貝HPV16基因組的CaSki細胞中的甲基化程度很高[26]。與SiHa細胞(1～2拷貝/細胞)相比，CaSki細胞中存在超量的HPV16基因組(>500 拷貝/細胞)，兩種細胞系的E6/E7轉錄本數量類似。E6/E7致癌基因的轉錄主要受不同細胞轉錄因子與位于HPV16基因組LCR轉錄調控元件的結合和相互作用的調節[27]。有研究顯示，位于增強子fp5e結合位點或啟動子HpaⅡ結合位點的CpG二核苷酸的甲基化作用能夠阻止功能性轉錄復合物的形成[28-29]。研究發現，某些核蛋白可與轉錄激活因子競爭位于LCR fp5e和Hpa Ⅱ以外的甲基化CpGs位點，并通過HDAC實現甲基化相關修復作用誘導更緊密的染色體構型，從而實現轉錄抑制[29-30]。此外，HPV16中的E2蛋白可與其LCR同源結合位點構成調節環，并根據調節環的不同位點激活或抑制早期基因的轉錄[31]。體外研究發現，增強子內以E2為主以及異源輸入的E6/E7病毒蛋白能夠誘導顯著的再甲基化，并在一定程度上導致啟動子區域自身的甲基化或與染色體閉合相關的轉錄抑制[29]。

通過LCR中CpG的甲基化模式可更好地反映基因沉默情況。但關于HPV16自然感染CpG甲基化對病毒基因轉錄影響的報道較少。Park等[32]對9例口腔鱗狀細胞癌患者的RNA標本進行研究證實，HPV16基因組中LCR的超甲基化與可檢測到的E6/E7表達水平相關。此外，其他小樣本研究也得到了類似的結論[33-34]。Vinokurova和von Knebel Doeberitz[35]對HPV16感染宮頸組織樣本的微分裂細胞甲基化的分析證明，來自損傷或轉化細胞的HPV16基因組任何位置的甲基化均與鱗狀上皮分化的各階段相關。由此可見，廣泛病毒基因的甲基化可以阻止病毒基因的表達，使細胞中的病毒基因組處于非激活狀態，且不引發任何病理效應?；谝延凶C據的內在聯系推測，HPV16基因組甲基化可能是早期病毒致瘤基因參與宮頸上皮內瘤變發展的敏感指標。明確CpG甲基化與自然感染狀態下HPV16轉錄的關系，將有助于更好地了解HPV相關宮頸病變的發生機制。

3 HPV16 DNA甲基化與病毒載量的相關性

HPV載量反映了病毒的活躍程度，病毒載量和DNA甲基化均為HPV感染后宮頸鱗狀細胞癌發生過程的特異性分子事件。目前研究的含HPV16的宮頸癌細胞系有SiHa細胞和CaSki細胞，前者細胞中僅含有2個具有轉錄活性的病毒基因拷貝，而后者細胞中含有較多的病毒基因拷貝，但僅有1個整合于14號染色體的拷貝具有轉錄活性。細胞學實驗證實，HPV16基因拷貝數與甲基化水平相關，HPV16基因拷貝的CaSki細胞中啟動子和增強子的CpG位點甲基化水平明顯高于SiHa細胞，且CaSki細胞中多余的沉默拷貝可在5-氮雜胞嘧啶核苷的作用下重新獲得轉錄活性[36-38]。除影響細胞啟動子和增強子甲基化外，還可通過調節E2、E6/E7的甲基化水平調控病毒的復制和轉錄，使細胞表現出穩定的基因型，可見HPV16的表達可能取決于病毒啟動子、增強子和E2基因的甲基化狀態[34]。既往研究也證明，由HPV16感染引起的宮頸病變中的E2區域也會發生不同程度的甲基化，其中癌細胞E2區域甲基化的程度最高，但其在宮頸癌前病變細胞與正常宮頸細胞的甲基化水平的差異不大，故E2基因甲基化水平可用來區分正常細胞、癌前病變細胞與宮頸癌細胞[21]。在組織學實驗中，Mirabello等[22]采用實時定量聚合酶鏈反應檢測237例 HPV感染者的HPV16載量，并采用焦磷酸測序法定量檢測HPV16 L1區和LCR 66個位點的甲基化水平，未發現病毒載量與甲基化之間的相關性。已知HeLa細胞和C4-Ⅰ細胞是HPV18型宮頸癌的主要細胞系，其中HeLa細胞為宮頸腺癌細胞系，含有較多的HPV18基因拷貝，其含量約為50個，而C4-Ⅰ細胞中整合的HPV18基因拷貝含量極少[39]。與HPV16感染不同，感染HPV18的HeLa和C4-Ⅰ細胞中的HPV18 DNA啟動子和增強子區域均為低甲基化，但在HeLa細胞HPV18 L1區的甲基化水平顯著高于C4-Ⅰ細胞。通過對宮頸脫落細胞HPV-18 L1基因進行甲基化特異性聚合酶鏈反應定量檢測的實驗研究發現，宮頸癌患者HPV-18 L1基因始終處于高甲基化狀態，但無癥狀患者的HPV-18 L1基因常為低甲基化或未甲基化狀態。在宮頸癌前病變中，L1偶發高甲基化，且疾病嚴重程度與L1高甲基化程度相關[39]。此結果在組織學實驗中也得到了證實，對HPV18感染的宮頸癌組織標本和無癥狀感染者的宮頸組織標本進行L1/L2片段甲基化水平檢測發現，80%的癌組織標本的L1區存在甲基化，且明顯高于無癥狀感染組；病毒整合后，L1區甲基化可促使其余HPV18基因拷貝喪失活性[40-41]。綜上所述，L1基因甲基化可作為篩查HPV18感染所致宮頸病變的指標。HPV16和HPV18是宮頸癌的常見病毒感染類型，兩者LCR的轉錄元件和轉錄因子相同。大量研究發現，HPV16和HPV18的DNA甲基化模式不同，其甲基化模式可調節病毒表達，并在病毒整合過程中發揮重要作用[13,22,39]。HPV的DNA甲基化及病毒載量可能存在一定關聯，但其生物學意義的關聯尚不清楚。

4 結 語

目前，尚無準確快捷的HPV感染檢測方法。HPV DNA檢測的敏感性很高，但診斷宮頸癌的特異性較巴氏涂片檢測低。與液基薄層細胞學檢測技術相比，HPV檢測的假陽性率較高。高危HPV DNA重復篩選獲得了較高的宮頸癌診斷敏感性和特異性，但隨訪費用較高，不易廣泛使用。近年來，已明確了HPV DNA甲基化修飾在宮頸癌發生中的重要作用。HPV DNA甲基化檢測可能成為具有潛在應用價值的區分感染結局的生物標志物，有助于探索病毒基因組和生命周期以及與宿主的相互作用，更全面地了解HPV感染導致的疾病過程、更準確地檢測臨床癌前病變、更個性化地識別和管理具有真正進行性致癌潛力的病變。HPV DNA甲基化檢測不僅可以豐富其他生物標志物的早期診斷和預后評估標志，提高臨床檢測的敏感性和特異性，還可改善宮頸癌放療和化療的敏感性，為新藥開發提供幫助。