方 慶

（商丘職業技術學院，河南 商丘476100）

引言

隨著生物科技的發展，人類對生物的研究已經由生物個體、細胞、染色體轉向分子領域.目前，幾乎每個生物學科都在運用染色體核型分析技術研究染色體，試圖從微觀方面了解更多的有關生命的奧秘.在園藝作物上，商宏莉、郭英發表了《6個無花果品種的染色體組型研究》［1］；牛學南發表了《百合科三種植物的核型分析》［2］；戴小紅發表了《百合三品系代表品種的核型分析》［3］；李國泰發表了《大葉芹染色體的核型分析》［4］；汪衛星發表了《番木瓜的核型分析》［5］及《輪葉黨參染色體核型分析》［6］；呂芳德發表了《山核桃屬部分種的核型分析》［7］；申定健發表了《柑桔屬6種植物染色體核型比較分析》［8］……綜合以上研究者的研究，可以看出他們所研究的對象不同，但所用方法基本相似（核型分析），要進行核型分析研究，則必須先做好細胞染色體壓片工作.做好染色體壓片是進行核型分析的前提和關鍵.

目前，根尖細胞壓片技術廣泛運用在植物染色體分析上，但此壓片技術在操作程序、取材時間、解離時間等方面都可以提出不同的處理方法［9-11］.因此，我們于2018年4至6月期間對大蒜等幾種材料的染色體壓片方法進行了研究，對其進行細胞染色體核型分析，擬找到最好的壓片程序及方法，為進行核型分析及下一階段試驗奠定堅實的基礎［12-13］.

1 材料與方法

1.1 材料

采用豌豆根尖、大蒜根尖、石榴根尖和莖尖為試驗材料.

1.2 方法

1.2.1 取材

取正在生長的根尖1cm-2cm，在一天之中的不同時間進行取材.

1.2.2 預處理

用0.002mol／L 8-羥基喹啉30℃處理2.5h.

1.2.3 固定

放在固定溶液中固定20min-40min，洗凈其醋酸后移入70%酒精中保存.

1.2.4 解離材料在50%酒精中浸泡5min，再用蒸餾水洗滌1min，后轉入1mol／L冷鹽酸（室溫）浸泡1min，再轉入1mol／L鹽酸（60℃恒溫）浸泡40min，接著轉入1mol／L冰鹽酸浸泡1min，再接著置于2%果膠酶水溶液中，在室溫下處理30min，最后取出洗滌1-2次.

1.2.5 染色

一般情況下，經過固定的材料馬上進行染色效果較好（染色清晰而且染色體易分散）.若經體積分數70%的酒精長期保存后，雖然細胞質也容易著色，但染色體會有不同程度的黏結，所以分散性差.本試驗是將固定好的材料用蒸餾水反復洗幾遍，然后將材料放入已預熱至60℃的1M HCL中保溫10min左右，然后用常溫1M HCL洗1次，最后把材料轉入Schiff試劑中，在10℃黑暗條件下染色1h-5h.染色結束后將材料轉到蒸餾水中或45℃的醋酸中.

1.2.6 壓片

給被染色后的材料蓋上蓋玻片放在平整的桌面上，在蓋玻片上蓋兩層吸水紙，用左手手指壓緊，防止蓋玻片滑動，然后用右手持一解剖針，用針柄輕敲蓋玻片，使材料均勻分散開及細胞分散壓平.也可用右手的拇指輕壓蓋玻片，使材料分散.

本試驗按傳統染色方法將解離后的根尖放置在載玻片上，同時用刀片切取1mm-2mm根尖，滴加1滴配置好的染液，并用解剖針搗碎根尖.放置約10min，待根尖染成暗紅色，加蓋玻片，用吸水紙放在蓋玻片上面，用右手拇指在吸水紙上對準根尖輕壓，或用鉛筆柄端輕輕敲擊，將根尖材料壓成一均勻薄層，注意不要移動蓋玻片（為了觀察方便，可在蓋玻片下墊一張白紙）.

1.2.7 鏡檢

一般來說，在制成的染色體玻片標本中，染色清晰而且分散良好的中期分裂相總是少數，所以，在壓片之后需要認真地進行鏡檢.鏡檢時先用低倍鏡進行觀察，找到一個好的視野后再轉用高倍鏡觀察.合格的壓片，可用防水墨水在蓋片和載片的交界處劃線作記號，作為制作永久壓片時封片的標記.

一張優良的細胞染色體壓片至少應符合如下條件：

1）在一張壓片中應有較多的中期分裂相；2）染色體分散而不重疊；3）染色體不扭曲、斷裂，主縊痕、隨體等清晰；3）壓片基本上為一層平展的細胞，觀察時視野內所看到的細胞都處在一個平面上；4）染色體著色較深，而細胞質不著色或著色很淺，背景清晰無過多雜質.

1.2.8 染色體觀察

將載有樣品的玻片置于顯微鏡下觀察，若染色較淺，可從蓋玻片一側加灑液，同時在另一側用濾紙吸引染料，還可將載玻片在酒精燈上微微加熱，這樣染色體著色效果會更好些.如果分散不夠，難以計數，可取下載玻片，重新鋪上吸水紙，再次敲打，必要時也可用手指從吸水紙上對蓋玻片施加適度壓力，如此常會得到十分滿意的結果.但須注意，手指壓力不可過大，否則會壓破細胞，造成染色體的流失、斷裂或卷曲變形.

2 結果分析

2.1 不同材料根尖細胞壓片效果比較

如圖1、2、3所示，可以清楚地看出：用大蒜根尖細胞所做的壓片最好；其次是豌豆；最差的是石榴.主要原因在于木本植物（如石榴）比草本植物的根尖細胞壁的纖維素層致密，不易解離和搗碎.

圖1 石榴根尖細胞

圖2 豌豆根尖細胞

圖3 大蒜根尖細胞

2.2 不同解離時間對材料搗碎難易程度的影響

草本植物根尖較易搗碎，顯微鏡下細胞分散良好，觀察效果清晰，木本植物根尖則較難搗碎，尤其是木本植物的莖尖更難搗碎.材料越易搗碎越容易做切片.因此，一般多用根尖做切片.從表1可以看出，解離時間對材料的搗碎程度有顯著影響，解離時間越長材料越易搗碎.（說明：解離是指用鹽酸浸泡材料.另外，解離后的材料，需15min-20min搗碎為難搗碎；10min-15min搗碎為較難搗碎；5min-10min搗碎為中等搗碎；2min-3min搗碎為易搗碎）通過對材料搗碎難易程度的把握，可以篩選出適宜材料的解離時間.

表1 解離時間對材料的影響

2.3 經酶處理與未經酶處理的切片效果比較

用0.2%果膠酶對大蒜、豌豆和石榴的根尖細胞處理30min，并與未處理的根尖細胞作對照，可以看出，經過酶處理的根尖細胞切片效果較好.因為果膠酶可以溶解細胞壁果膠質成分，從而使細胞壁解體，在顯微鏡下可以清晰看到細胞核部分，周圍有細胞壁輪廓.如圖4、5所示：

圖4 未處理的豌豆根尖細胞

圖5 處理過的豌豆根尖細胞

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 材料的準備和選擇

通過試驗發現，在選擇制片材料時，其準備工作較為復雜.如果材料的新根生長慢或因休眠等原因而未能長出新根，則影響試驗的進行；石榴的種子長出的新芽易發生褐變，也會影響到試驗觀察效果.另外，通過試驗我們發現，在一天之中，晚上取材比早上和中午取材效果好，三者由好到差依次為晚上＞早上＞中午.在試驗過程中，試驗需要用到的最重要的器材是顯微鏡，通過反復試驗對比發現，如果要清晰地觀察細胞染色體結構，必須使用高放大倍數和分辨率的顯微鏡.

3.1.2 操作中注意事項

為了在切取根尖時便于操作，同時為了防止在固定以及解離過程中材料的丟失，應該切取較長根尖（一般1cm-2cm）.在染色壓片時，切取最短根尖（大約1mm-2mm），最好使用放大鏡等工具加以輔助，以便準確地切取最頂端根尖.因為石榴莖尖頂端的生長點不明顯，只有左右對稱的兩片嫩葉（自動封頂現象），因此，可用頂端上部葉腋內的側芽生長點代替.

3.1.3 解離時間的把握

解離時間的長短直接影響后續的搗碎操作的難易程度和壓片效果的好壞.若解離時間不足，搗碎困難，壓片會出現未分開的組織塊，時間過長則不利于制作.解離時間應視材料而定 ，一般木本植物材料解離時間應適當延長，草本植物材料解離時間應適當縮短.

3.2 結論

實驗結果表明：1）一般情況下，用草本植物的根尖細胞做壓片材料比木本植物效果好；2）制作壓片效果的好壞取決于解離的好壞和搗碎的程度；3）對于同一植物材料，在一定的范圍內，解離的時間越長搗碎分散細胞的效果越好，用0.2%果膠酶處理30min的細胞壓片較未經0.2%果膠酶處理30min的效果好，其細胞核暴露完全.