質譜對甲氧西林耐藥和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌的鑒定價值

吳文強，仇玉蘭

(山西醫科大學 公共衛生學院， 太原 030001)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 是臨床常見高毒性致病菌之一，通過釋放多種細胞外毒素，如腸毒素、溶血素、殺白細胞毒素等而表現出較強的致病力[1]。多見于醫源性感染、社區獲得性感染等病灶中，以皮膚及軟組織感染最為常見，但也能作為敗血癥、中毒性休克等疾病的致病菌[2]。MRSA被認為是“超級病菌”之一，感染后難于控制。因此，準確及時地鑒別MRSA和MSSA，監測MRSA的流行情況，對于及時向臨床提供治療方案和控制感染極為重要。

臨床上常用的用于檢測金黃色葡萄球菌耐藥表型的方法有紙片擴散法、肉湯稀釋法、Etest 方法等，這些方法需對細菌進行培養18～24 h來觀察結果，耗時較長。質譜技術因其鑒定速度快、準確率高的特點而引起廣泛重視。近年來，MALDI-TOF-MS 已經成功應用于細菌的快速鑒定和耐藥性研究[3]，例如檢測耐藥株和敏感株指紋圖譜的改變[4-5]。已有部分研究將 MADLI-TOF MS 用于鑒定MRSA，有實驗發現 MRSA 和 MSSA 在500～3 500 m/z范圍內的質譜峰存在差異[6-7],但是沒有探討質譜特異峰對鑒定MRSA和 MSSA的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選取2017年3月—2018年2月期間在本院接受治療的患者1153例；男595例，女558例，年齡22～75歲，年齡平均(44.25±10.95)歲；來自骨科、呼吸內科、外科及皮膚科等多個科室。納入標準：① 入院后接受血尿常規、血生化檢驗，結合影像學檢查，明確相應診斷；② 患者意識清楚，無精神疾病；③ 所有患者均對本次研究內容知情同意，自愿參與，并同醫院簽訂知情同意書。排除標準：① 哺乳、妊娠以及準備妊娠的女性患者；② 心肝腎等重要臟器嚴重疾病、血液系統疾病、傳染性疾病、腫瘤患者；③ 診療依從性較差，無法判定療效，或因資料不全導致影響療效的判斷者。

1.2 方法

所有患者均收集體液、血液及壞死性組織等樣本，并進行檢測，分離出致病菌后，利用全自動微生物鑒定及藥敏分析系統最終確定為金黃色葡萄球菌。經質譜儀鑒定后，聯合ClinPro Tools軟件建立模型[8]分析MRSA及MSSA質譜圖差異，并驗證質譜圖特征峰對MRSA和MSSA的鑒定價值。

1.2.1樣本收集

患者需在清晨空腹狀態下收集體液(包括痰液、尿液及分泌物以及血液)。清水漱口后用力咯痰，將痰液樣本置于無菌容器內，送檢實驗室。尿液需在碘伏棉球清潔外陰后，取第1次排尿的中段尿，置于無菌容器內，送檢實驗室。分泌物收集分2種：一為陰道分泌物，患者均為女性，所有受檢者均在采集樣本前72 h避免性生活，將一次性采樣拭子送入宮頸口后采集樣本；二為皮膚分泌物，經無菌操作規則，刮刀或勺體采集分泌物。常規皮膚消毒后，靜脈穿刺取外周循環血液樣本8～10 mL至血培養瓶后送到實驗室。常規皮膚消毒后，經皮穿刺或支氣管鏡穿刺獲取體內組織樣本，皮膚組織樣本在無菌操作規則下，經無菌刮刀通過皮膚刮擦獲取樣本。

1.2.2微生物鑒定以及體外藥敏試驗

所有樣本經35 ℃培養24 h后，分離出致病菌，并利用法國生物梅里埃VITEK2-Compact全自動微生物鑒定以及藥敏系統(生物梅里埃股份有限公司生產)GP卡片和GP67卡片進行鑒定。以ATCC29213金黃色葡萄球菌為標準菌株，對儀器進行質量控制。以苯唑西林MIC值≥4 μg/mL為MRSA，苯唑西林MIC≦2 μg/mL為MSSA作為判定標準[9]，共分離出MRSA 58株，MSSA 42株。

1.2.3菌株保存

將分離到的金黃色葡萄球菌菌株各自編號，用無菌濾紙收集后凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.4樣品制備和質譜分析

隨機選取26株MRSA和19株MSSA，將凍存的菌落接種于羊血瓊脂培養皿，35 ℃孵育過夜，并按照Bruker 公司給出的標本前處理指南用乙醇-甲酸法提取MRSA和MSSA的核糖體蛋白。質譜儀采用反射正離子模式，使用大腸埃希菌標準品進行曲線校正，40%激光強度，檢測器范圍為2 000～20 000 m/z，通過利用 Flex Control version 3.0 software(Bruker)軟件采集質譜圖，每個靶點采集一張質譜圖。

1.2.5模型建立與驗證

使用布魯克公司提供的Clinpro Tools(3.3.0版本)軟件(遺傳算法)建立模型并驗證。建立ClinPro Tools模型，特異峰納入標準為:① 峰值在所有菌株中，分析分類值均>70%[10]，② 峰值強度>2 000。分析甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌及敏感金黃色葡萄球菌特征圖譜重合率、峰質荷比。利用其他32株MRSA和23株MSSA對此模型進行驗證，經與MIC法比對，評價特征峰值對區分MRSA與MSSA的鑒定價值。

1.3 數據分析

本次研究利用Excel軟件處理數據，利用百分比(%)表示計數資料，計算其靈敏度以及特異度。

2 結果

1 153例患者分離出金黃色葡萄球菌100株，其中，MRSA 58株(58.00%)，MSSA 42株(42.00%)。隨機抽取MRSA和MSSA分別為26株、19株建立ClinPro Tools模型后，根據納入標準找到MRSA主要特征峰質荷比共2個，即2 305.6Da以及3 007.3Da。利用其他32株MRSA和23株MSSA對此模型進行驗證。與MIC法比對，結果顯示特征峰1靈敏度71.9%，特異度82.6%；特征峰2靈敏度68.8%,特異度87%。將兩點聯合起來，靈敏度為90.6%，特異度為73.9%(表1)。

表1 質譜法與MIC法比較的四格表

注：峰值1為2 305.6Da，峰值2為3 007.3Da，峰值3為2 305.6Da，聯合為3 007.3Da。

3 討論

由金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病近幾年來在臨床上威脅越來越大，隨著抗生素的廣泛應用，其耐藥菌株日益增多，特別是MRSA具有多重耐藥性，對常用的抗生素如大環內酯類、氨基糖甙類、氯霉素和四環素等均表現出耐藥性[11]，在美國臨床與實驗室標準協會(CLSI) M100 S28文件中介紹，MRSA對所有β內酰胺酶藥物均表現為耐藥[9]。需要注意的是，造成感染的金黃色葡萄球菌不僅包括MRSA，還包含MSSA[12],兩者治療方案不盡相同，合理使用抗生素可以延緩耐藥菌的產生。傳統病原菌微生物診斷方法具有耗時長、流程復雜等局限性，而且診斷后存在一定的誤差率，不僅對微生物判斷產生一定的差錯，還能影響診療方案的制定及臨床療效的判斷。因此，優化以金黃色葡萄球菌為代表的病原微生物診療方案具有非常重要的臨床價值。

MRSA耐藥表型由染色體上的mecA基因介導。MRSA的檢測方法有很多種，如脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分型、重復性基因外回文序列聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)分型、多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)分型和葡萄球菌染色體mec基因(staphylococcal cassette chromosomemec，SCCmec)分型等[13]。這些方法均對MRSA亞型有良好的鑒定和區分能力[13-14]。但它們操作復雜、時間長且成本較高，且PCR檢測mecA 基因的方法可以確定細菌是否存在mecA基因，但并不能完全確定細菌表現為耐藥，因為mecA基因編碼蛋白的量的多少也會影響到細菌耐藥性表型的差異[15]。

質譜技術是目前臨床上應用的優質鑒定方法之一，具有敏感性高、準確率高及通量高等特點，能夠通過蛋白質峰值的差異進行細菌的判讀，廣泛應用于臨床檢驗、食物檢驗等領域中[16]。已有文獻指出，MALDI-TOF技術可成功用于MRSA的分子分型[8]，但需警惕樣本培養時間變化可能引起該樣本質譜分析結果發生的變化[17]。

本文主要使用MALDI-TOF技術分析MRSA及MSSA特征圖譜重合率、峰質荷比。本次研究共找到有意義的特征峰2個，MRSA主要特征峰質荷比2個，2 305.6 Da和3 007.3 Da，MSSA主要特征峰質荷比是6 816.7 Da。之后驗證鑒定正確率，結果顯示特征峰1靈敏度71.9%，特異度82.6%；特征峰2靈敏度68.8%,特異度87%；將兩點聯合起來，靈敏度為90.6%，特異度為73.9%。其中單個標本鑒定耗時10 min左右。該方案能夠在短時間內快速區分MRSA與MSSA，具有良好的臨床應用價值。

不足的是，本次試驗樣本量有限，可能漏檢更有意義的特征峰；沒有嚴格控制峰強度，每株細菌只用質譜儀鑒定一次，無法避免偶然錯誤帶來的影響。