采用聚丙烯酰氨凝膠電泳技術鑒別龜甲及其混偽品△

徐清，李夢，羅雪梅，孟杰親，張帆，陳秀芬，劉春生，楊瑤珺*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700

龜甲為龜科動物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲，具有滋陰潛陽、益腎強骨、養血補心、固精止汗的作用，用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、頭暈目弦、虛風內動、筋骨痿軟、心虛健忘、崩漏經多等癥[1]。

龜甲及其混偽品藥材在活體動物上的鑒別有很強的鑒別特性，易于區分，但在處理成龜甲藥材時或在處理成粉末時，帶有鑒別特征的龜甲條紋外層部分易脫落，增加了性狀鑒別的難度[2-4]。2015版《中華人民共和國藥典》中規定的龜甲鑒別方法為薄層色譜法，通過查閱相關文獻[5-7]及前期實驗，發現薄層色譜法對不同品種龜甲的鑒別有一定局限性，高效液相色譜法分析時間較長且操作較復雜，故筆者采用SDS-PAGE電泳技術對龜甲及其混偽品的蛋白質條帶進行初步鑒別，從蛋白水平上對其進行鑒別研究。

1 材料

1.1 樣品

樣品為來自表1中不同產地及批次的共53批龜甲及混偽品藥材，其中35批龜甲為正品龜甲，經北京中醫藥大學楊瑤珺教授鑒定，均為龜科動物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲。

1.2 儀器

電泳儀(型號AE-8135，ATTO公司)；電泳槽(型號Tetra System，Bio-Rad)；玻璃板(長板/短板，Bio-Rad)；灌膠架(型號1653304，Bio-Rad)；加樣梳[10孔(1 mm)(Bio-Rad)]；超聲清洗器(型號KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司)；冷凍離心機(3K-15低溫高速離心機，SIGMA公司)；脫色搖床(型號TS-1，其林貝爾儀器銷售公司)；玻璃培養皿(型號100 mm，北京高華偉業食品添加劑有限公司)。

1.3 試劑

蒸餾水(規格4.5 L，廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；SDS(規格100 g，北京博邁德科技發展有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(規格500 g，北京化工廠)；鹽酸(規格100 mL，北京化工廠)；丙烯酰胺(規格100 g，北京化工廠)；甘氨酸(規格500 g，北京化工廠)；蔗糖(規格500 g，北京化工廠)；考馬斯亮藍G250(規格25 g，北京化工廠)；蛋白Marker(規格20次，北京拜爾迪生物技術有限公司)；四甲基乙二胺(規格50 mL，北京拜爾迪生物技術有限公司)；4×樣品緩沖液(規格5 mL，北京拜爾迪生物技術有限公司)；Ripa裂解液(規格50 mL，北京拜爾迪生物技術有限公司)；胰蛋白酶(規格1 g，北京拜爾迪生物技術有限公司)。

表1 龜甲樣品信息

2 方法

2.1 樣品制備

取研磨后的正品龜甲細粉樣品，用液氮再次研細，精密稱取20 mg，加入4×蛋白質Loading Buffer 100 μL，雙蒸水300 μL，將其稀釋成1×的緩沖液，100 ℃水浴10～20 min，冷卻后，用冷凍離心機14 000 r·min-1離心10 min，取上清液至1.5 mL離心管中，存放至4 ℃環境備用。

2.2 膠板制備

2.2.1 分離膠(12%)和濃縮膠(5%)的配制 按表2配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)(需要在最后向制膠器中倒入凝膠前再加)，加的時候要迅速，防止膠提前凝固。所需試劑及具體用量見表2。

表2 SDS-PAGE配制所需試劑 mL

注：—表示不添加試劑。

2.2.2 膠板的制備 用蒸餾水將玻璃板沖洗干凈并晾干。按照裝置的說明書組裝好制膠器，用水檢測是否漏水。吸取配好的12%離膠，注入兩玻璃板之間至約占整個板的四分之三的高度。待分離膠凝固好，倒凈兩塊玻璃板中剩余的液體，注滿5%的濃縮膠，插入梳子，放置2 h以上。待濃縮膠完全凝固后緩慢拔出梳子，用電泳緩沖液填滿點樣孔準備點樣。

2.2.3 SDS-PAGE電泳 將離心得到的上清樣品與4× Protein Loading buffer按照3∶1的比例充分混勻。渦旋混勻后，沸水浴15～20 min使蛋白變性，沸水浴之后立即放置冰上冷卻2 min，再用14 000 r·min-1離心2 min。將離心之后的上清液進行點樣(10 μL)，先用80 V的電壓使蛋白條帶跑過濃縮膠，再調整電壓至120 V，待蛋白條帶跑到玻璃板底部即可停止跑膠。

2.2.4 膠板的染色與脫色 將膠小心地從玻璃板中取出，用考馬斯亮藍染色液染色，振蕩過夜。倒出染色液，將膠放入脫色液中，多次振蕩脫色，直到蛋白條帶清晰，藍色背景脫掉為止。將凝膠拍照并保存。

3 結果

3.1 龜甲背甲及腹甲藥材的SDS-PAGE

通過對不同品種龜甲背甲與腹甲的SDS-PAGE電泳實驗發現，對于同一品種的龜甲，其背甲與腹甲的蛋白質亞基相似，電泳得到的蛋白質條帶幾乎無明顯差別，難以通過一維電泳方法對龜甲的背甲與腹甲進行區分。在本實驗中其蛋白質亞基幾乎沒有區別，以至于蛋白條帶幾乎相同，同時也意味著在后續本實驗中無需將龜甲背甲與腹甲分開進行討論。

圖1 2a2b對比圖

圖2 3a3b對比圖

圖3 4a4b對比圖

圖4 5a5b對比圖

圖5 6a6b對比圖

圖6 13a13b對比圖

3.2 不同批次正品龜甲的SDS-PAGE

通過得到的電泳圖發現(見圖7～8)，該20批正品龜甲藥材分離得到的蛋白亞基幾乎相同，即正品龜甲在一維電泳中顯現出的蛋白亞基條帶差異性很小，其得到的蛋白條帶及蛋白分離情況不易受產地、批次等因素影響，同時也可看出龜甲的一維電泳實驗有較強的穩定性與重現性。

圖7 1～10批正品龜甲電泳膠圖

圖8 11～20批正品龜甲電泳膠圖

3.3 正品及偽品龜甲藥材的SDS-PAGE

結果見圖9。

通過比較分析圖9，可以看出各品種龜甲的蛋白條帶各有差異，蛋白亞基的分子質量均在10～200 kDa。在63～180 kDa，12個品種的龜甲蛋白質條帶相似，無明顯區別；在15～63 kDa，各品種的龜甲蛋白質條帶有明顯區別；在11～15 kDa以及11 kDa以下，各品種的龜甲幾乎無明顯蛋白條帶，難以進行區分。故可以推測各品種龜甲分離出的蛋白在63 kDa以上的大分子量范圍內很相似，可能有很多共同蛋白。若想計算某一蛋白條帶的蛋白分子量，對蛋白Marker條帶進行遷移率的計算并與對應的蛋白分子量做標準曲線，得到方程即可知道未知條帶的蛋白分子量。

注：1.為正品；5、3、6～14.為偽品。圖9 正品及混偽品龜甲電泳膠圖

正品龜甲(樣品1)除遵守上述規律外，還可以觀察到在42 kDa蛋白分子量附近，有明顯的蛋白條帶，以及在25 kDa附近，有兩條很細的顏色稍淺的蛋白條帶且幾乎連在一起，在21 kDa附近，有一條較粗的顏色稍深的蛋白條帶，在14～19 kDa，有3條高豐度蛋白聚合在一起，這“二細一粗三聚合”的條帶群，可以初步作為鑒別正品龜甲和其他龜甲混偽品的依據，因為通過上述多次平行及對比實驗，發現正品龜甲的蛋白條帶均能滿足這一特點，故將這部分蛋白條帶與其他品種的龜甲進行區分。

為了更好地觀察各品種龜甲的蛋白條帶，對所得膠圖蛋白條帶尤其是差異明顯的15～63 kDa部分進行條帶歸類分析，有條帶記為1，無條帶記為0，以Marker及特征明顯的蛋白分子量為準來觀察各品種龜甲在不同位置下是否也有同等分子量的蛋白條帶，具體信息見表3。

對比電泳膠圖及歸類整理后的蛋白條帶歸類表，可以發現蛋白分子量在63 kDa以上時無法將各品種龜甲鑒別開，且在135、130、65 kDa等蛋白分子量位置上，各品種龜甲均有相同條帶。對上述數據進行聚類分析，通過得到的聚類樹狀圖可以對上述12品種的龜甲蛋白條帶信息進行進一步分析，從而更好地對龜甲及其混偽品進行鑒別。分析見圖10。

表3 樣品蛋白條帶有無情況

圖10 龜甲及其混偽品藥材蛋白條帶聚類圖

聚類分析結果：以不同品種龜甲蛋白條帶譜的相似系數為距離，采用系統聚類法對以上數據進行聚類，得到的結果與膠圖的蛋白條帶以及對蛋白條帶的分析結果均相似，根據各品種(系)間遺傳距離的遠近來統計分析，同一組內各品種(系)間遺傳距離較近，不同組間各品種(系)遺傳距離較遠。故樣品9、11為一組，7、8為一組，1、3為一組，這3組樣品的相似性較高，其次樣品6、12為一組，4、5為一組，這兩組樣品的相似性較差。

4 討論

對采集的不同產地及批次的多批正品龜甲藥材進行電泳實驗，發現其分離得到的蛋白條帶幾乎相同，蛋白亞基條帶差異性很小，即同一品種的龜甲其蛋白分離得到的條帶難以受產地、批次等因素影響，有較強的穩定性和重現性。

對聚類結果進行觀察，發現分到同一組的樣品可能由于種屬比較近似，如1號樣品烏龜為龜科水龜屬，3號樣品黃喉擬水龜為龜科擬水龜屬；7號樣品小鱷龜與8號樣品大鱷龜均為鱷龜科鱷龜屬，可能其相似性較多以至于電泳的條帶比較相似，因此將電泳得到的龜甲的蛋白條帶譜特征部分作為不同品種龜甲分類的補充依據的同時，要注意是否存在電泳條帶相似的黃喉擬水龜龜甲藥材。