九香蟲及相似品的多糖組成分析△

李莎，宋淑敏，晏仁義，馬曉晶，陳科力，黃璐琦，，李娟，*

1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065；2.天津益倍生物科技集團有限公司，天津 300457；3.中國中醫(yī)科學院 博士后科研流動站/中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700

九香蟲AspongopuschinensisDallas為蝽科兜蝽屬昆蟲[1]，是重要的藥用昆蟲和保健食品[2]。作為中藥，其具有理氣止痛、溫中助陽的功效[3]。現(xiàn)代研究表明，九香蟲有抗菌、抗癌、止癌痛、促血管生成等藥理作用，臨床多用于治癌痛、下焦虛寒病癥、小兒厭食癥、陽痿等[4]。九香蟲作為保健食品，在我國食品養(yǎng)生方面有著悠久的歷史，多在四川、貴州和云南等地入鍋炒食使用，民間將九香蟲泡酒用作壯陽之品[3-6]。研究表明，九香蟲富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素以及多種微量元素等[7]。

目前市場上對九香蟲需求日益增大，其價格也居高不下，九香蟲誤用、混用現(xiàn)象增多，嚴重影響質(zhì)量問題嚴重。進一步探索九香蟲多糖組成，并且與市場上常見的混淆品小皺蝽、黑兜蟲、無刺蝽、荔蝽多糖組成進行比較，本研究采用柱前衍生化HPLC對九香蟲及其相似品多糖組分進行分析。

1 材料

1.1 儀器

DZF-6020真空干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；DZTW電子調(diào)溫電熱套[邦西儀器科技(上海)有限公司]；DK-8D電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；LC-2030C 3D高效液相色譜儀[島津制作所(日本)]；Inertsil ODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技公司)。

1.2 試藥

無水乙醇(5 L)購自上海沃凱生物技術(shù)有限公司；D-甘露糖(25 g)、D-木糖(25 g)、D-阿拉伯糖(25 g)、L-鼠李糖(25 g)、D-半乳糖醛酸(25 g)、D-半乳糖(25 g)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(100 g)購自上海麥克林生化科技有限公司；D-葡萄糖(500 g)購自天津市風船化學試劑科技有限公司；巖藻糖(20 mg)購自成都瑞芬思生物科技有限公司，硫酸(500 mL)、鹽酸(500 mL)購自北京化工廠；氫氧化鈉(500 g)、三氯甲烷(500 mL)購自天津市康科德科技有限公司；乙腈(4 L)購自上海星可高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

九香蟲及其相似品經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學陳科力教授鑒定，具體信息見表1。

表1 九香蟲及其相似品樣本信息

2 方法

2.1 多糖的提取

稱取10.00 g樣品，按料液比1∶30加入300 mL水，加熱回流提取1 h，提取兩次，合并上清液，減壓濃縮至25 mL，加入4倍體積的乙醇(終濃度為80%)醇沉，4 ℃靜置過夜，離心取沉淀，置于真空干燥箱內(nèi)烘干，得粗多糖。

2.2 多糖含量測定

按苯酚-硫酸法測定多糖的含量[9]。

2.3 糖的衍生化

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖對照品適量，置于5 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，配置成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1混合對照品溶液。吸取混合對照品100 μL，按照樣品衍生化步驟進行衍生化。

2.3.2 供試液制備 1)酸水解組：分別稱取上述干燥后的多糖適量，配置成質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的水溶液。吸取上述配置后的溶液各100 μL于試管中，加入70 μL 2.5 mol·L-1硫酸，110 ℃烘箱中水解2 h，取出冷卻后，用70 μL 5 mol·L-1NaOH溶液中和，得水解液。2)未酸水解組：樣本直接溶解后衍生化。

2.3.3 樣品衍生化 向上述水解液或未酸水解的溶液中加入200 μL PMP甲醇溶液0.5 mol·L-1和100 μL NaoH溶液(0.3 mol·L-1)，并旋渦混合，70 ℃水浴反應(yīng)60 min，冷卻，再用100 μL 0.3 mol·L-1HCl中和。再向其中加入1 mL水，2 mL三氯甲烷萃取3次，取水相，過膜。

2.4 單糖組成分析

色譜柱：Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；檢測波長：250 nm；流動相：乙腈(A)，水900 mL、乙腈100 mL、0.45 g kH2PO4、0.5 mL TEA pH 7.5(B)；梯度洗脫(0～4 min，6%A；4～5 min，6%～12%A；5～40 min，12%A；40～40.01 min，12%～6%A；40.01～48 min，6%A)。

2.5 主成分分析

使用SIMCA-P軟件對單糖組成進行主成分分析(PCA)。采用主成分分析法，通過觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達九香蟲及其相似品的多糖組成差異。

3 結(jié)果

3.1 多糖含量

按2.1項下方法對九香蟲及其相似品(小皺蝽、荔蝽、黑兜蟲、無刺蝽)進行多糖提取，提取率平均值分別為：(7.92±3.31)%、(8.60±2.72)%、(7.44±1.84)%、(7.97±1.18)%、(8.36±1.67)%。數(shù)據(jù)顯示，九香蟲及其相似品的多糖提取率相差不大，得率接近8%，其中小皺蝽相對最多，荔蝽相對最少。采用苯酚-硫酸法測得多糖質(zhì)量分數(shù)平均值：九香蟲為(5.23±3.68)%，小皺蝽為(17.64±5.73)%，荔蝽為(6.02±0.45)%，黑兜蟲為(7.05±3.50)%，無刺蝽為(10.56±3.26)%。數(shù)據(jù)顯示，九香蟲及其相似品的多糖含量差異較大，其中小皺蝽的多糖含量明顯較多。

3.2 單糖組成比較

按照2.3.2項下方法對九香蟲及其相似品進行酸水解，再對水解產(chǎn)物、非水解產(chǎn)物和單糖對照品分別進行柱前衍生化，再按照2.4項下方法利用HPLC對PMP衍生化的單糖對照品和多糖水解物和未水解物進行色譜分析。混合標準單糖PMP衍生物的HPLC分析結(jié)果見圖1，九香蟲及其相似品未水解組PMP衍生物的HPLC見圖2，多糖的水解單糖PMP衍生物的HPLC分析結(jié)果見圖3，使用SIMCA-P軟件對單糖組成進行PCA結(jié)果見圖4。九香蟲及其相似品的單糖組成及其單糖含量(峰面積)結(jié)果見表2。

由圖2可知，所有類型的樣本未酸水解圖一致，15 min后沒有雜峰，表明水提醇沉已去除游離單糖。由圖3可知，九香蟲及其相似品的樣本中，以甘露糖、葡萄糖、半乳糖為主，且普遍葡萄糖含量高。

圖1 混合標準單糖PMP衍生物的HPLC圖

注：1.九香蟲；2.小皺蝽；3.荔蝽；4.無刺蝽；5.黑兜蟲。圖2 九香蟲及其相似品未水解組PMP衍生物的HPLC圖

注：1.九香蟲；2.小皺蝽；3.荔蝽；4.無刺蝽；5.黑兜蟲。圖3 九香蟲及其相似品多糖水解物PMP衍生物的HPLC圖

表2 九香蟲及其相似品的單糖組成及其單糖含量(峰面積)

注：—表示未檢測到此處有相對應(yīng)的峰及峰面積。

其中九香蟲多糖中均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等單糖，但單糖組成比例差異較大，部分樣品甘露糖含量大于葡萄糖含量，而其余九香蟲多糖主要是由葡萄糖構(gòu)成。小皺蝽多糖主要是由葡萄糖構(gòu)成，并且其含量較大。無刺蝽多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖構(gòu)成，此外還有少量的鼠李糖，除個別樣本中葡萄糖含量較低外，其余無刺蝽多糖中甘露糖、葡萄糖和半乳糖的組成比例相似。荔蝽和黑兜蟲多糖主要也是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等單糖組成，且單糖組成比例差異不大。

由表2可知，在甘露糖、葡萄糖、半乳糖的比例上，九香蟲及其相似品同品種各樣品之間較為接近，但個別樣本稍有差異，主要由于藥材炮制、加工和貯藏等因素的影響。按其比例知，九香蟲、荔蝽的甘露糖、葡萄糖、半乳糖的含量差異不大，而小皺蝽、黑兜蟲的葡萄糖部分明顯高于其他兩種單糖含量，無刺蝽葡萄糖含量也高于其他兩種單糖含量。

注：圖中數(shù)字代表批次號。圖4 九香蟲及其相似品不同批次樣品單糖組成主成分分析圖

從主成分分析結(jié)果看出，九香蟲、小皺蝽、無刺蝽、荔蝽、黑兜蟲，除個別離群值，各品種樣本基本分布在不同區(qū)域，說明九香蟲及其相似品的多糖組成存在明顯差異。其中小皺蝽、無刺蝽、荔蝽幾個品種不同批次的樣本分布比較集中，說明這幾個品種多糖組成組內(nèi)均一性比較好，即多糖組成接近；而九香蟲和黑兜蟲不同批次的樣本分布比較離散，說明這兩個品種的多糖組成組內(nèi)差異較大。

4 討論

多糖以及聚合糖是有機體不可缺少的主要成分，如研究最多、最廣泛的甲殼素，是構(gòu)成昆蟲以及其他動物外殼的主要物質(zhì)。逯春玲等[8]對土鱉蟲、九香蟲、僵蠶3種昆蟲類藥材總多糖含量比較，認為多糖可以作為質(zhì)量控制指標；馮穎等[10]對云南常見的5種食用蝽象的營養(yǎng)成分分析結(jié)果表明，平均總糖質(zhì)量分數(shù)為2.61%。九香蟲及類似品的多糖含量存在一定差異，整體規(guī)律是：油脂含量高的樣品多糖含量相對較低；小皺蝽的多糖含量相對偏高，其次為無刺蝽。小皺蝽的多糖主要由葡萄糖組成，與其他品種的多糖組成差異較大；除小皺蝽外，其他品種多糖組成相似，主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等單糖組成；雖然不同藥材多糖中的單糖組成比例存在一定的差距，但是除個別樣品外，均為葡萄糖含量最高。

從主成分分析來看，九香蟲的聚合度不高，這與筆者檢測的九香蟲DNA條形碼的結(jié)果相似，不能聚合為一類，原因可能為九香蟲中存在隱存生物多樣性。課題組前期對九香蟲類藥材進行了系統(tǒng)的性狀和顯微鑒定[11]，發(fā)現(xiàn)黑兜蟲與九香蟲極相似，本實驗中九香蟲和黑兜蟲不同批次的樣本分布比較離散，組內(nèi)差異較大，單糖組成不能作為區(qū)別九香蟲和黑兜蟲的依據(jù)。而小皺蝽與無刺蝽與九香蟲區(qū)別明顯，可作為品種鑒別的依據(jù)。本實驗通過檢測九香蟲類藥材多糖中單糖組成，為九香蟲類藥材的品種鑒定和品質(zhì)評價提供一定的依據(jù)。