基于DNA條形碼分子技術的海龍及其混偽品鑒定研究△

張紅印，金平，劉冬，高曉晨，張輝

長春中醫藥大學，吉林 長春 130117

中藥海龍在我國有悠久的應用歷史，是常用的名貴珍稀動物藥之一，具有溫腎壯陽、散結消腫的功效。首載于《本草綱目拾遺》，表述其藥效“功倍海馬”。2015版《中華人民共國藥典》(《中國藥典》)中規定，海龍藥材為海龍科動物刁海龍SolenognathushardwickiiGray、擬海龍SyngnathoidesbiaculeatusBloch或尖海龍SyngnathusacusLinnaeus的干燥體[1]。于夏、秋二季捕撈；刁海龍、擬海龍，洗凈，除去皮膜，曬干；尖海龍個體較小直接洗凈，曬干。

隨著人們生活水平的提高，健康意識的增強，中醫藥保健應用已成為我國人民的日常需求，海龍、海馬等海洋中藥，在補益身體使用上由來已久，據相關研究表明，海龍藥材含有豐富的生物活性成分，包括總甾體類化合物、蛋白質、人體必需氨基酸、微量元素鋅、錳、銅等[2]。具有溫腎壯陽、延緩衰老、抗腫瘤、增強機體免疫力、加強心肌收縮力、緩解骨質疏松、降低膽固醇、治療老年性癡呆癥等作用[3-6]。但隨著市場需求逐年增加，海龍野生資源的緊缺，價格持續增長，市售海龍藥材中出現了摻偽、摻假等現象，2015版《中國藥典》未收錄的不同來源海龍藥材銷售比例逐年加大，致使海龍藥材市場流通混亂。常見的混偽品有寶珈海龍MicrophisboajaBleeker、粗吻海龍TrachyrhamphusserratusTemminck et schlegel、海蠋魚HalicampuskoilomatodonBleeker和貢氏柄領海龍SolenognathusguntheriDunjker等種類[7]。

中藥材DNA條形碼鑒定技術是20世紀新興的分子鑒定手段，其基于中國傳統醫藥的特點，與最新的分子生物學技術相結合，突破了傳統的中藥鑒定技術手段，在基因分子水平對藥材來源進行分析，達到了準確、快速鑒別中藥材真偽的目的[8]。隨著關注度的持續增長，相關研究和實驗技術已日益完善，已于2014年被增錄到2010版《中國藥典》(增補版)中，并被2015版《中國藥典》第四部正式收錄，成為了具有國家標準的中藥鑒定新手段[9]。DNA條形碼鑒定技術，不限于藥材來源物種的生長周期和形態學變化影響，能夠有效改善傳統鑒定技術鑒定周期長、適用性低的特點，有效維護中藥材流通的正常秩序，為人們的健康生活提供保障。本項目通過前期文獻研究考察，擬定了海龍樣品采集計劃，并通過中藥材DNA條形碼鑒定技術對海龍及其市售樣品進行鑒別，以達到快速、高效鑒別海龍的目的。

1 材料

1.1 儀器

PCR儀(Bio-Rad，USA)；1-14K型高速冷凍離心機(Sigma公司)；球磨儀(Retsch MM400，Germany)；Nano Drop 2000/2000C分光光度計(Thermo Fisher Scientific，USA)；微量移液器(Eppendorf，Germany)；凝膠成像系統。

1.2 樣品

本實驗共收集海龍及其混偽品7個物種129份樣品(見表1)和66條來自GenBank數據庫的樣品序列(見表2)，經長春中醫藥大學張輝教授鑒定，憑證樣本保存于長春中醫藥大學。

表1 海龍及其混偽品樣品信息

表2 GenBank來源序列信息

2 方法

2.1 DNA提取

對收集到的海龍樣品，用75%乙醇擦拭表面后，采用紫外燈照射消毒。取樣品腹部部位時，需用手術刀片刮去內外腐爛殘留，避免污染；取樣品尾部部位時，刮去樣品表皮即可。取樣量約為40 mg，用球磨儀研磨2 min(30次/s)，樣品DNA使用血液、細胞、組織基因組提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.Ltd.，China)進行提取。因海龍蛋白含量較高，在樣品裂解消化結束后，加入1.5倍體積的三氯甲烷-異戊醇(24∶1)溶液，充分混勻，離心(12 000 r·min-1，5～10 min)，用于去除蛋白類雜質，防止對后續實驗產生影響。所得樣品DNA，采用NanoDrop 2000/2000c紫外-可見分光光度計檢測，根據測得的樣品濃度和A260/A280比值判斷樣品DNA質量。

2.2 PCR擴增及測序

擴增引物采用中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則規定的COI序列通用引物[9-10]，正向引物為HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，反向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；PCR反應體系為25 μL體系，包含2×TaqPCR Mix(Takara Bio，China)12.5 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL、引物各1.0 μL(2.5 μmol·L-1)(Sangon Biotech Co.，Ltd.，China)，樣品DNA約2 μL。反應條件：94 ℃預變性1 min，開啟1循環，94 ℃變性1 min，45 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，共5循環；開啟2循環，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；循環完成后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用ABI3730XL測序儀(Applied Biosystems Co.，USA)進行雙向測序。

2.3 序列處理及結果分析

測序峰圖利用CodonCode Aligner V8.0.2(CodonCode Co.，USA)和DNA man(Lynnon Biosoft，USA)拼接并校正，切除正反引物，獲得長度為650 bp左右的樣品序列，對于從GenBank獲得的COI序列，通過分析軟件，與所得的海龍樣品序列比對后，切除與海龍樣品序列相對應以外的區段，保留長度≥600 bp的有效序列。最后將全部序列用MEGA7.0(molecular evolutionary genetics analysis)分析軟件比對，基于K2P模型進行遺傳距離分析，用鄰接(NJ)法構建系統聚類樹，利用bootstrap(1000次重復)檢驗各分支的支持率。

3 結果

3.1 海龍藥材樣品DNA提取與PCR擴增

海龍及其市售藥材均以干燥體出售，部分藥材經過晾曬、烘干處理，導致藥材DNA出現了不同程度的降解，本實驗所提取的海龍樣品DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示部分樣品條帶呈彌散狀，表明DNA有一定程度降解。海龍所有樣本均可以成功進行PCR擴增，見圖1。

注：M.Marker；CK.空白對照；1～8.海龍樣品。圖1 部分海龍樣品的PCR擴增電泳圖

3.2 海龍種內及種間變異分析

海龍及其混偽品COI序列片段長度為658 bp。刁海龍不同來源樣品共16份，變異位點較少，在622 bp位置A-G變異；擬海龍不同來源樣品共16份，變異位點較少，在641 bp位置G-A變異。尖海龍不同來源樣品共16條，變異位點較少，在547 bp位置C-T變異。混偽品寶珈海龍不同來源樣品共35份，變異位點較少，在301 bp位置C-T變異，511 bp位置G-A變異，512 bp位置A-G變異；粗吻海龍不同來源樣品共45份，在44、345、502 bp位置C-T變異，249 bp位置T-C變異，312、315、432、627 bp位置A-G變異，351、513 bp位置G-A變異；海蠋魚共6份，在103、178、265、550 bp位置T-C變異，100、322 bp位置G-A變異。貢氏柄領海龍不同來源樣品共4條。基于K2P模型計算遺傳距離，3種正品海龍藥材來源種內最大K2P距離均小于0.017，種內平均K2P距離為0.005，均遠遠小于海龍藥材與其混偽品序列種間最小K2P距離。

3.3 海龍及其混偽品的序列鑒定

通過鄰接(NJ)法利用所得實驗序列和GenBank數據庫中序列所構建的系統聚類樹(見圖2)可以看出，海龍藥材不同來源個體均聚在一起，單獨聚為一支，具有明顯單系性，各類混偽品的對應序列也分別單獨聚為一支。因此，COI序列條形碼可準確鑒別海龍及其混偽品。

圖2 海龍及其混偽品的鄰接(NJ)樹(bootstrap 1000次重復)

4 討論

4.1 海龍及其混偽品樣品DNA提取

海龍質地堅韌，骨質化程度高，提取DNA時，難以裂解完全，且市售海龍均經過曬干和烤干等炮制處理；部分商家為使樣品美觀，還進行了熏硫漂白，致使DNA含量減少。本研究經過預實驗，按DNA提取試劑盒說明操作，所得樣品DNA質量不能達到后續的實驗要求，因此對DNA提取試劑盒操作進行部分優化，成功獲得了較為理想的樣品DNA。樣品前處理時，使用工具清除樣品外皮及內臟殘留，用75%乙醇進行表面擦拭，紫外燈照射消毒處理，防止外源性污染；提取DNA時，增加了GA、GB、蛋白酶K的加入量和樣品的裂解時間，以達到更好的裂解效果，在裂解完成后加入1.5倍體積的三氯甲烷-異戊醇(24∶1)進行抽提，12 000 r·min-1離心5～10 min，吸取上層清液。

4.2 DNA條形碼鑒定技術在動物藥鑒定中的應用

2015版《中國藥典》中共收錄了51種動物藥，包含76種藥用動物來源，所收錄的動物類藥除鹿類、蛤蚧、烏梢蛇、水蛭、中華大蟾蜍等已具備規范化養殖外，其余大部分藥材來源還是以野生資源為主，如穿山甲、海龍、海馬等，隨著野生資源的大量開發，藥源逐漸緊缺，致使價格持續增長，為追求利益，藥材市場上混偽品充斥現象較為普遍，嚴重擾亂了藥材市場秩序，增加了臨床用藥的安全隱患。中藥材DNA條形碼鑒定方法的提出，有效補充了傳統中藥鑒定方法的不足，在名貴動物藥鑒定中的作用尤為重要。賈靜等[11]基于DNA條形碼分子鑒定技術對傳統名貴珍稀動物藥穿山甲進行了成功鑒別，并對穿山甲常見的混偽品進行了序列比對分析，結果表明，DNA條形碼鑒定技術能夠有效鑒別穿山甲及其混偽品。張改霞等[12]基于COI條形碼對海馬及其混偽品21個物種211份樣品進行了種間種內序列分析、DNA Barcoding gap檢測，構建了系統發育樹，研究結果表明，各不同來源海馬正品與混偽品均能明顯區分開。嚴華等[13]采用優化的DNA提取方法對阿膠原材料及其混偽品進行了DNA條形碼鑒定，結果表明，鑒定結果準確可行。

4.3 海龍藥材市場考察及DNA條形碼鑒定的意義

本研究在樣品采集過程中，研究人員親自現場考察，在走訪過程中發現，在安徽亳州藥市、廣西玉林藥市、廣州清平藥市上銷售的海龍藥材，主要以刁海龍(四角龍，商家習稱，下同)、擬海龍(三角龍)、尖海龍(海針)、寶珈海龍(六角龍)、粗吻海龍(小海龍)、貢氏柄領海龍(大肚海龍)等種類為主，混偽品貢氏柄領海龍售價高于正品及其余混偽品，銷量最好的海龍是尖海龍、寶珈海龍、粗吻海龍；同時，在收集粗吻海龍樣品過程中，還發現粗吻海龍中混有少量海蠋魚進行銷售。通過對海龍藥材產地的文獻進行整理總結[14-16]，研究人員對海龍產地進行了實地考察，結果發現，在山東省青島市碼頭、海南省海口市碼頭和文昌市環球碼頭等地，海龍藥材產量相對較少，種類以粗吻海龍為主。藥材市場中海龍藥材多采用庫存式銷售，其貨源多以進口為主，隨著海龍價格的持續走高，也刺激了亞洲、非洲等地走私海龍的積極性，其來源多為亞洲沿海國家菲律賓、馬來西亞和非洲沿海國家索馬里、坦桑尼亞等地，這些非法的海龍藥材來源，銷售價格遠低于刁海龍，對藥材市場海龍行情沖擊較大。

本研究基于DNA條形碼鑒定技術，對海龍及其市售樣品DNA條形碼鑒定研究，證實了中藥材DNA條形碼鑒定技術在海龍及其混偽品鑒定中的可行性，為海龍鑒定的標準化提供了新的思路，也為名貴珍稀動物類中藥市場的規范化提供可靠的市場管理和監控手段。