高通量測序技術在輔助生殖技術領域的應用

王媛媛

【摘 要】高通量基因測序技術的迅猛發展，極大地拓寬了人類高通量基因測序技術/篩查（PGD/PGS）的適用范疇，提高了 PGD/PGS的準確性。胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術的基礎上，對具有遺傳疾病風險夫婦的卵母細胞或者植入前的胚胎進行活檢，利用分子生物學技術檢測，選擇無遺傳學疾病的胚胎植入女方子宮。胚胎植入前遺傳學篩查（Preimplantation Genetic Screening PGS）即對植入前配子或者行體外受精所獲得的胚胎進行染色體數目或者結構的篩查，從而選擇遺傳信息正常的胚胎移植，減少流產的發生，提高輔助生殖的的成功率。PGS 主要適用于女方高齡（≥35歲），IVF反復植入失敗，反復流產和嚴重的男性不育等患者。

【關鍵詞】高通量基因測序技術;胚胎植入前遺傳學診斷;胚胎植入前遺傳學篩查

【中圖分類號】R715.5 ? ?【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-8714（2019）12-0076-02

高通量測序技術可以對數百萬個 DNA 分子進行同時測序。這使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，因此也稱其為深度測序（ deep sequencing） 或下一代測序技術（ next generation sequencing，NGS） 。高通量基因測序技術的迅猛發展，極大地拓寬了人類胚胎植入前遺傳學診斷/篩查（PGD/PGS）的適用范疇，提高了 PGD/PGS的準確性。胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術的基礎上，對具有遺傳疾病風險夫婦的卵母細胞或者植入前的胚胎進行活檢，利用分子生物學技術檢測，選擇無遺傳學疾病的

胚胎植入女方子宮。胚胎植入前遺傳學篩查（Preimplantation Genetic Screening PGS）即對植入前配子或者行體外受精所獲得的胚胎進行染色體數目或者結構的篩查，從而選擇遺傳信息正常的胚胎移植，減少流產的發生，提高輔助生殖的的成功率。PGS 主要適用于女方高齡（≥35歲），IVF反復植入失敗，反復流產和嚴重的男性不育等患者。

1 PGD/PGS的取材來源

1.1 卵母細胞極體 卵母細胞第一極體活檢在獲卵后進行，第二極體活檢在受精后18～22 h進行，ET前有足夠的時間進行分析，可以進行新ET，并且不會影響胚胎的繼續發育，安全性較高，但是僅提供來自母源性的遺傳信息，有明顯的局限性。

1.2 卵裂球 卵裂球是臨床上應用最廣的PGD活檢來源[1]。多數研究表明在胚胎發育至第 3 天（7～9細胞）移走 1～2 個細胞并不影響胚胎的繼續發育[2]，但是卵裂球細胞活檢的材料少，只有 1～2 個細胞進行檢測，另外卵裂期胚胎存在高嵌合率[3]，發生率為 35%～40%，影響 PGD/PGS 的準確性。

1.3 囊胚囊胚滋養外胚層可以活檢5～10個細胞，較之單細胞活檢提供更多的材料，提高了PGS的準確性。一方面活檢部分不包括內細胞團，從而避免了對胚胎所造成的不利影響[4]。另一方面囊胚期胚胎嵌合體率較低。有研究表明滋養外胚層活檢優于卵裂期活檢[5]。但是目前現有的培養體系囊胚形成率僅有20%～50%，限制了可供檢測的胚胎數目。

2 PGD/PGS檢測技術的發展

2.1 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction PCR）單基因疾病的檢測多采用PCR. PCR技術使用耐熱DNA聚合酶（現多用Taq DNApolymerase），擴增特定DNA片段，其能夠將極少量的遺傳物質進行指數級擴增，得到足夠數量的DNA。但是PCR污染、擴增效率低和等位基因脫扣（allele? drop-out，ADO）等問題的存在影響PCR的準確性。

2.2 熒光原位雜交技術（fluorescence? in? situ? hybridization，FISH）FISH是將標記上熒光素的探針與待測樣本的DNA進行雜交，收集熒光信號，從而對待測基因檢測分析。在PGD/PGS中，FISH主要應用于性別鑒定，染色體數目、結構異常（易位、倒位等）的篩查，對于FISH-PGS能否改善IVF-ET的臨床結局，目前國內外尚無定論。

2.3 比較基因組雜交技術（comparative? genomic? hybridization，CGH）和微陣列-比較基因組雜交技術（array-CGH）這是FISH技術的一大延伸和突破，是一種不同于FISH單一或者數個DNA序列探針的多基因組檢測技術[6]。

2.4 單核苷酸多態性-微陣列（single? nucleotide? polymorphism-array，SNP-array）SNP是由單個核苷酸的改變引起的DNA序列多態性。與a CGH不同，SNP-array是將具有特定堿基序列作為基因探針測定待測序列的堿基類別，SNP-array比CGH和FISH更為精細，準確，廣泛應用于遺傳學病因診斷和PGD/PGS等領域。

2.5? 高通量測序技術（high-throughput sequencing）又稱下一代測序技術（Next-generation” sequencing），是對傳統測序的一次革命性改變，以大規模并行測序同時對幾十萬到幾百萬條DNA進行測序。高通量測序技術的高度靈敏性、準確性、靈活性、運營成本低、周期短、產量大等特點使得其在藥物的篩選、疾病基因研究、遺傳病、腫瘤、產前診斷、PGD/PGS等領域顯示出巨大的作用[7]，實現了對沒有參考序列的物種進行從頭測序，獲得該物種的參考序列，而對有參考序列的物種，通過重測序在全基因組水平上檢測并發現突變位點，發現個體差異的分子基礎。

分子生物學技術的發展為PGD/PGS提供了各種各樣的檢測技術，然而各種技術都有其優缺點和適用范圍。PCR主要適用于單基因病，檢測時間比較短，但檢測位點有限，且易于出現污染，擴增效率低和等位基因脫扣等問題，而FISH主要適用于染色體非整倍性和性連鎖疾病的檢測等，檢測結果清晰、直觀，但是最多僅能對15條染色體檢測，不能對全部23對染色體進行檢測，且漏檢率比較高。隨后發展的Array-CGH和SNP-array主要用于染色體非整倍性、微缺失和微重復等的檢測，能對全部染色體進行檢測，分辨率較高，分別為1Mb和1.5Kb，但基因芯片制作難度大，成本高，且只能檢測出已知的異常，然而單細胞高通量測序技術基于全基因組測序可以實現染色體異常和單基因病的同時檢測[8]，雖然建立時間比較短，但高度的靈敏性、準確性、靈活性、運營成本低、產量大等特點使其顯示出巨大的優勢，隨著該技術的進一步完善成熟，將成為PGD/PGS的一個強有力的檢測手段。

參考文獻

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