基于高通量分析方法的長江干流重慶段抗生素種類特征及來源初探

石運(yùn)剛，卓麗，陳靜華，蔣小萍，蔡鳳珊，嚴(yán)驍，鄭晶，鐘昌琴,*，劉嘉烈

1. 重慶市固體廢物管理中心，重慶 400020 2. 國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣州 510655 3. 西南石油大學(xué)，成都 610500

抗生素一般指能夠殺滅或抑制微生物的一類次級代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用在人類疾病防治、水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧養(yǎng)殖中[1]。由于人和動物對抗生素的吸收效率低，大部分抗生素以原藥或代謝產(chǎn)物的形式被直接排出體外，進(jìn)入水體等環(huán)境介質(zhì)[2-3]。目前在多種水體環(huán)境中均有抗生素檢出，包括污水處理廠進(jìn)出口廢水、養(yǎng)殖廢水、地表水、地下水、甚至飲用水源[4-9]。

在長江流域已檢出多種抗生素，主要包括磺胺嘧啶和紅霉素等[10]，唐娜等[11]在長江南京段表層水體中共檢出8種磺胺類化合物。孫雨等[12]在長江南京段水源地水樣中檢測到四環(huán)素、紅霉素、羅紅霉素和氯霉素。封麗等[13]在三峽庫區(qū)主要水域包括長江干流和6條支流水體中檢出磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和其他類等4類抗生素。長江干流重慶段處于長江水系的上游，是長江經(jīng)濟(jì)帶的重要組成部分，其流域范圍內(nèi)工農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)，上游服務(wù)于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的青海、甘肅等地，下游服務(wù)于經(jīng)濟(jì)繁華、人口密集的上海、江蘇等地，其抗生素污染值得重點(diǎn)關(guān)注。

目前，靶向分析方法仍然是環(huán)境中抗生素識別的主要方法[14]。李紅英等[15]通過建立快速篩查數(shù)據(jù)庫同時測定化妝品中的6種抗生素類化合物，王培鋒等[16]建立了動物源食品中31種抗生素的快速篩查方法。盡管這些方法可以檢測幾百種物質(zhì)，但是靶向分析涵蓋的種類仍不夠，如需對多種類污染物同時分析，仍然存在耗時費(fèi)力等缺點(diǎn)，難以達(dá)到污染物快速篩查的目的，為彌補(bǔ)靶向分析的不足，非目標(biāo)分析的高通量篩查方法應(yīng)運(yùn)而生[17]，如可疑物篩查方法和非靶向篩查方法，針對種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的污染物可實(shí)現(xiàn)快速定性定量分析。郭惠衛(wèi)等[14]通過建立有毒有害物質(zhì)快速篩查方法在固體廢棄物樣品中成功地鑒定出6種危廢物質(zhì)。

本研究采用液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-QTOF/MS)，構(gòu)建抗生素篩查數(shù)據(jù)庫，對重慶市的11個斷面水體、2個市政污水處理廠進(jìn)水和6個養(yǎng)殖場未處理廢水中的潛在抗生素進(jìn)行了篩查，了解了重慶市流域抗生素污染情況，并結(jié)合抗生素使用調(diào)查，分析了流域抗生素的排放源，為長江干流重慶段抗生素監(jiān)測和管理提供重要依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 采樣點(diǎn)的布置和樣品采集

本次調(diào)查時間為2018年6—7月，水樣采自長江干流重慶段，以及匯入長江干流的嘉陵江和烏江的11個流域斷面(W1～W11)、2個污水處理廠進(jìn)水口(W12～W13)和6個養(yǎng)殖場(W14～W19)。采樣布點(diǎn)情況見表1、表2和圖1。市政污水處理廠選擇原則為廢水排放量大、服務(wù)人口多、服務(wù)區(qū)域內(nèi)醫(yī)院集中的，采集廢水處理設(shè)施進(jìn)水口的水樣，采集量為1 L。重慶市的畜禽養(yǎng)殖以豬、牛、羊和雞為主，水產(chǎn)養(yǎng)殖以四大家魚為主，因此，在重慶市主要養(yǎng)殖區(qū)域選擇了8家規(guī)模較大的典型養(yǎng)殖場，各采集未處理廢水1 L。在每個流域斷面的左中右水面下0.5 m處分別采集水體，共采集2 L水體，在棕色玻璃瓶混合均勻后，加入50 mL色譜純甲醇和400 μL 4 mol·L-1H2SO4，樣品避光冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并在48 h內(nèi)處理。

表1 流域采樣位點(diǎn)基本信息Table 1 Basic information of sampling sites in the basin

圖1 采樣位點(diǎn)分布圖Fig. 1 Distribution map of sampling sites

表2 污水處理廠和養(yǎng)殖場采樣位點(diǎn)基本信息Table 2 Basic information of sampling sites in sewage treatment plants and farms

1.2 樣品預(yù)處理及儀器分析

1.2.1 樣品預(yù)處理

水體樣品過GF/F濾膜(直徑142 mm，孔徑0.7 μm)后進(jìn)行固相萃取。預(yù)先用甲醇、超純水各10 mL活化HLB小柱，加入2 mL pH=3的稀鹽酸緩沖液，樣品以5 mL·min-1的流速進(jìn)行萃取。用10 mL甲醇洗脫HLB小柱，洗脫液用氮吹吹干，以1 mL甲醇定容，0.22 μm濾膜過濾后，貯存于棕色進(jìn)樣瓶中。

1.2.2 儀器分析

Agilent 1290 LC液相色譜，Agilent 6545 QTOF/MS四級桿/飛行時間質(zhì)譜儀，采用電噴霧離子源，正負(fù)離子(ESI±)全掃描模式，m/z范圍50～1 000。采用C18反相高效液相色譜柱，流動相(正負(fù)模式相同)中，A為5 mmol·L-1乙酸銨+0.05%甲醇水溶液(體積比)；B為甲醇；正模式流速為0.3 mL·min-1，負(fù)模式流速為0.4 mL·min-1，進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為45 ℃；碰撞氣為氮?dú)膺M(jìn)行梯度洗脫。正負(fù)洗脫梯度如下：正模式中A流動相以70%保持8 min后，在16 min內(nèi)由70%降至50%，再在18 min內(nèi)降至10%并保持6 min，總分析時間48 min；負(fù)模式下A流動相以70%保持4 min后，在8 min內(nèi)由70%降至50%，再在8 min內(nèi)降至10%并保持4 min，總分析時間為24 min。

1.3 樣品檢測

1.3.1 數(shù)據(jù)庫的建立

實(shí)驗(yàn)室已有57種常見抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，另外從“國家基本藥物目錄”、“農(nóng)業(yè)部獸用處方藥品種目錄”、“食品動物用獸用抗菌藥物臨床應(yīng)用分級管理目錄”中篩選出其他256種無標(biāo)準(zhǔn)品的抗生素，建立共313種目標(biāo)抗生素的篩查數(shù)據(jù)庫。

在Agilent-PCDL軟件中錄入有標(biāo)準(zhǔn)品的抗生素信息，包括保留時間、精確質(zhì)量數(shù)以及對應(yīng)的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建有標(biāo)準(zhǔn)品的抗生素篩查數(shù)據(jù)庫。對于無標(biāo)準(zhǔn)品的抗生素，通過Agilent-PCDL軟件錄入分子式、CAS號、精確分子質(zhì)量數(shù)以及化學(xué)結(jié)構(gòu)式，構(gòu)建無標(biāo)準(zhǔn)品的抗生素篩查數(shù)據(jù)庫。

1.3.2 樣品檢測

共檢測23個樣品，包括2個質(zhì)量控制樣品(1個程序空白和1個溶劑空白)，11個流域水體樣品、2

個污水處理廠進(jìn)水樣品和6個養(yǎng)殖場未處理廢水樣品。除甘寶素和倍他米隆在程序空白中有檢出且響應(yīng)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他檢出樣品外，其余所有抗生素在程序空白和溶劑空白中均無檢出，這表明實(shí)驗(yàn)過程的誤差得到了控制。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素識別

2.1.1 流域水體檢出抗生素

由圖2可知，在11個流域水體中共檢出38種抗生素，其中抗病毒藥類檢出數(shù)量最多，其次是大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、抗真菌藥、喹諾酮類和其他類，這6類抗生素檢出數(shù)量占比達(dá)73.68%，為主要檢出類別。與已有的相關(guān)研究結(jié)果比較可以看出，以往報道在地表水中檢測到的抗生素類型主要為大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類，這與本研究結(jié)果一致(表3)。結(jié)合已有報道和本研究結(jié)果，可以認(rèn)為大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類在我國地表水中是一種普遍存在的抗生素。而抗真菌藥和喹諾酮類可能為長江干流重慶段水體中的特征抗生素類型。11個流域檢出抗生素的數(shù)量和類別存在差異，這與流域沿岸企業(yè)的分布相關(guān)。流域水樣與污水處理廠和養(yǎng)殖場檢出的抗生素的類別組成相似，這表明污水處理廠和養(yǎng)殖場產(chǎn)生的廢水最終排入流域內(nèi)，造成流域內(nèi)抗生素的積累。劉曉暉[20]對洞庭湖湖體中抗生素的污染來源進(jìn)行了初步探究，發(fā)現(xiàn)湖體中抗生素的主要來源為污水處理廠和養(yǎng)殖廢水。

2.1.2 污水處理廠和養(yǎng)殖場檢出抗生素

由圖3(a)可知，2個污水處理廠進(jìn)水和6個養(yǎng)殖場未處理廢水中共篩查獲得70種潛在抗生素，其中喹諾酮類檢出數(shù)量最多，其次是氨基糖苷類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、抗結(jié)核病藥類、抗病毒藥類和其他類，這7種類型的抗生素檢出數(shù)量占比達(dá)70%，為主要檢出類別。檢出率較高的抗生素類別均是較為常用的廣譜抗菌藥物，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、畜牧養(yǎng)殖等行業(yè)中[21-22]。

由圖3(b)可知，2個污水處理廠進(jìn)水中分別檢出抗生素36種和40種，以喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類和磺胺類為主。這幾類抗生素使用歷史較久，是目前臨床上常用的抗生素種類[23]，如氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢氨芐和紅霉素等是常規(guī)抗菌藥物，被廣泛用于多種疾病的消炎殺菌中，在醫(yī)院廢水中普遍被檢出[24]。市政污水處理廠進(jìn)水中抗生素的主要來源為醫(yī)療廢水以及生活廢水的排放，其抗生素使用范圍更為廣泛，用量更大，因此其檢出的抗生素種類相對較多[25]。6個養(yǎng)殖場廢水共檢出抗生素4～22種，以喹諾酮類和磺胺類為主。京津冀地區(qū)畜禽養(yǎng)殖廢水中檢出的主要抗生素也為磺胺類和喹諾酮類[26]。6個養(yǎng)殖場檢出類別和數(shù)量不同，這與抗生素藥物的使用量和養(yǎng)殖品種有關(guān)。妥布霉素僅在W15有檢出，妥布霉素用于山羊眼睛結(jié)膜炎的治療[27]。卡那霉素和喹乙醇僅在W18有檢出，卡那霉素可用于家禽的菌血癥、敗血癥、呼吸道感染和腹膜炎等治療[28]。W19點(diǎn)位檢出抗生素數(shù)量最少，僅磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、奧司他韋和甘寶素4種，這與水產(chǎn)養(yǎng)殖場中抗生素的使用量較少和流水稀釋作用等相關(guān)[29]。

2.1.3 水體中抗生素的空間分布

長江干流重慶段抗生素的檢出數(shù)量分布如圖4所示，抗生素檢出數(shù)量水平的空間差異明顯。在7個長江流域斷面中，抗生素的檢出數(shù)量為13～26，最高點(diǎn)位于W7(長江干流出境斷面)，最低點(diǎn)位于W4(國控考核斷面)。長江干流重慶段的抗生素檢出數(shù)量在空間上整體表現(xiàn)為上游(W1～W2)<中游(W3～W5)<下游(W6～W7)，這與沿岸污水處理廠和養(yǎng)殖場的分布有關(guān)。沿岸的污水處理廠和養(yǎng)殖場將含有高濃度抗生素的廢水排入長江，導(dǎo)致長江干流水體中可檢出抗生素數(shù)量增多[12]。由于支流水體自凈能力遠(yuǎn)低于干流，水體中抗生素的殘留濃度受水文條件影響較顯著[13]，嘉陵江水體中抗生素的檢出數(shù)量略高于長江，并且支流入境斷面抗生素的檢出數(shù)量均低于支流的匯入斷面。此外，養(yǎng)殖廠對抗生素的持續(xù)使用，可能造成某些采樣點(diǎn)位的抗生素濃度偏高[12]。

2.2 出入境斷面水體中檢出抗生素的分析

由圖5可知，3個入境斷面(W1、W8和W10)共檢出28種抗生素，出境斷面(W7)共檢出26種抗生素。22種抗生素在入境斷面和出境斷面均有檢出，表明長江干流重慶段出境斷面可能受河流徑流輸入的影響“接收”了入境斷面的大部分抗生素[30]；其中，甘寶素、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、甲氧芐啶、脫水紅霉素、羅紅霉素、氟苯尼考、倍他米隆、環(huán)吡酮胺和洛匹那韋10種抗生素在3個入境斷面均有檢出，克拉霉素、紅霉素、西諾沙星和斯塔夫定由斷面W8攜帶入境，氟康唑由斷面W10攜帶入境，氧氟沙星、對氨基水楊酸、依沙酰胺、氟胞嘧啶、奈替米星和替比夫定這6種抗生素在入境斷面檢出而未在出境斷面檢出，這與水稀釋、自然降解等作用有關(guān)[29]。泰勒菌素、頭孢沙定、奧司他韋和哌拉西林4種抗生素在出境斷面檢出而未在入境斷面檢出，可能是與重慶市內(nèi)的生產(chǎn)活動排放有關(guān)。

圖2 流域水體抗生素檢出情況注：a. 總體檢出類別； b. 各個采樣點(diǎn)檢出情況。Fig. 2 Identified antibiotics in the basin Note: a. Total category; b. Identified antibiotics at each sampling site.

圖3 污水處理廠和養(yǎng)殖場抗生素檢出情況注：a. 總體檢出類別； b. 各個采樣點(diǎn)檢出情況。Fig. 3 Identified antibiotics in the sewage treatment plants and farms Note: a. Total category; b. Identified antibiotics at each sampling site.

圖4 長江流域重慶段抗生素污染分布特征Fig. 4 Distribution of identified antibiotics in the Chongqing section of Yangtze River

2.3 檢出抗生素的溯源分析

由圖6可知，流域內(nèi)共檢出抗生素36種，入境斷面共檢出抗生素28種，污水處理廠和養(yǎng)殖場共檢出抗生素70種，污水處理廠和養(yǎng)殖場檢出抗生素數(shù)量明顯高于流域境內(nèi)，說明醫(yī)療用藥和獸用藥是抗生素最主要的來源[20]。

表3 中國地表水中抗生素的濃度Table 3 The reported concentration of antibiotics in surface water in China

圖5 出入境斷面抗生素相互關(guān)系韋恩圖注：W1、W8和W10是入境斷面，W7是出境斷面。Fig. 5 Venn diagram of antibiotics at the exit and entry sections Note: W1, W8 and W10 are entry sections; W7 is exit section.

圖6 抗生素相互關(guān)系韋恩圖Fig. 6 Venn diagram of antibiotics from different sources

對于本研究，甘寶素、氟康唑、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、甲氧芐啶、氧氟沙星、克拉霉素、紅霉素、脫水紅霉素、羅紅霉素、林可霉素、對氨基水楊酸、倍他米隆、環(huán)吡酮胺、西諾沙星、依沙酰胺、呋布西林、洛匹那韋和曲氟沙星這20種抗生素是通過上游攜帶和重慶市內(nèi)排放引入這2種方式進(jìn)入流域的。磺胺氯噠嗪、氟苯尼考、阿糖腺苷、乙酰甲喹、奈替米星、斯塔夫定和替比夫定由上游攜帶入境；泰勒菌素、頭孢沙定、奧司他韋、慶大-小諾霉素和磺胺米隆由重慶市引入長江，這5種抗生素通常在醫(yī)療和養(yǎng)殖行業(yè)廢水中檢出[31]；嗎啉胍、夫西地酸、西卡寧和哌拉西林4種抗生素只在流域檢出，表明這4種抗生素可能是由重慶市內(nèi)的其他排放源引入長江，這4種抗生素藥物常在醫(yī)療廢水中檢出[32]。此外有45種抗生素只在污水處理廠和養(yǎng)殖場廢水中檢出，可能是由于排水取向、使用量較少以及水流稀釋作用等未在流域中檢出[33]。

本研究基于建立抗生素數(shù)據(jù)庫和高通量分析方法，在長江重慶段水體、污水處理廠進(jìn)水和養(yǎng)殖場未處理廢水中成功篩查獲得83種抗生素，其中磺胺間甲氧嘧啶檢出率最高，喹諾酮類是檢出的主要抗生素類型；并且結(jié)合重慶市抗生素的生產(chǎn)使用情況，分析了抗生素的種類分布特征和主要來源。但高通量分析方法只能對抗生素進(jìn)行定性分析，因此本研究的討論僅基于檢出種類和檢出率。在后續(xù)的研究中，將對已檢出的抗生素進(jìn)行定量分析和風(fēng)險評估，為流域開展抗生素監(jiān)測和管理提供重要的理論支持。