三葉苷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究*

鄭斌婕 ，王李婷 ，熊 佩 ，張鳳娥 ，蔡 偉 △

（1.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南 懷化 418000； 2.湖南醫(yī)藥學(xué)院·侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418000）

木姜葉柯Lithocarpuslitseifolius（Hance）Chun 為殼斗科柯屬常綠植物，多分布在長(zhǎng)江以南的低山密叢中[1]，藥食兼用，可做茶、糖、藥[2]。其有清熱利尿、滋肝養(yǎng)胃、化痰、祛風(fēng)、降壓等功效，可用于治療濕熱痢疾、皮膚瘙癢、肺熱咳嗽、高血壓等癥[3]。近代醫(yī)學(xué)研究證明，木姜葉柯具有抗氧化[4]、免疫抑制[5]、降血糖[6]等藥理作用。三葉苷是其主要活性成分之一，具有抗糖尿病[7]、抗人類免疫缺陷病毒（HIV）-1感染[8]、抗炎[9-10]等作用。文獻(xiàn)[11]報(bào)道的三葉苷單體分離步驟煩瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。為高效提取、純化三葉苷并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，本試驗(yàn)中采用熱水回流提取，乙醇熱飽和結(jié)晶得成品，并結(jié)合波譜及薄層色譜對(duì)其進(jìn)行鑒定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括G1311B四元泵、4212BDAD型二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；AUW120D型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；Mighty-10型超純水機(jī)（上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司）；BZF-50型真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；薄層色譜（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

三葉苷對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為WKQ18052505，含量＞98.0%）；所用試劑均為分析純，水為超純水。木姜葉柯藥材購(gòu)自湖南省溆浦縣君健中藥材專業(yè)合作社，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院蔡偉副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取、分離與結(jié)晶

取木姜葉柯藥材0.1 kg，用粉碎機(jī)稍加粉碎，過(guò)2號(hào)篩，置2 000 mL圓底燒瓶中，以10倍量水在80℃條件下提取3次，每次1 h，得殘?jiān)蜑V液，合并濾液，于冰箱冷藏靜置12 h，濾過(guò)，得黃色沉淀物，減壓干燥（55℃）24 h，得三葉苷粗品。在無(wú)水乙醇溶液中緩慢加入三葉苷粗品，邊加熱邊溶解，待三葉苷飽和溶解后，冷卻溶解液得結(jié)晶，重復(fù)3次，干燥，得三葉苷純品。

2.2 水分測(cè)定

按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0832項(xiàng)下水分測(cè)定法第二法（烘干法）測(cè)定三葉苷純品中的水分。取三葉苷純品約2 g，置干燥至恒重的稱量瓶中，精密稱定，打開錐形瓶瓶塞，置105℃干燥箱中干燥5 h，移出，并迅速蓋上瓶蓋，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定，繼續(xù)干燥1 h，迅速取出，冷卻后稱定質(zhì)量，連續(xù)2次干燥后的質(zhì)量差小于5 mg時(shí)停止干燥，根據(jù)損失的質(zhì)量，計(jì)算三葉苷純品中水分含量，重復(fù)3次。結(jié)果三葉苷純品水分含量為（3.550 ±0.163）%。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

白色針狀結(jié)晶。1H-NMR （500 MHz，DMSO）δ：7.03（2H，d，J=8.0 Hz，H-2，H-6），6.66（2H，d，J=8.0 Hz，H-3，H-5 ），6.04（2H，S），4.88（1H，d，J=7.71 Hz），5.36（1H，d，J=5.82 Hz），5.13（1H，d，J=5.42 Hz），2.78（2H，t，J=7.66 Hz，H- β）。13C-NMR δ：131.49（C-1），129.20（C-2，C-6），155.42（C-4 ），115.09（C-3，C-5），45.77（C-α），29.32（C-β），205.07（C=O），105.23（C-1′），163.39（C-2′，C-6′），95.07 （C-3′，C-5′），163.74（C-4′），99.52（C-1″），73.05（C-2″），76.41（C-3″），69.41（C-4″），77.14（C-5″），60.48（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道結(jié)果基本一致，故鑒定化合物為三葉苷。

2.4 薄層鑒別

取三葉苷對(duì)照品和三葉苷純品各適量，分別加甲醇溶解制成對(duì)照品溶液和供試品溶液。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》TLC法試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別以石油醚-正丁醇（1 ∶8，V/V）、乙酸乙酯 -正丁醇（2 ∶1，V/V）、乙酸乙酯 -丙酮（3 ∶2，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見(jiàn)圖1。

3 討論

圖1 薄層色譜圖

三葉苷是木姜葉柯具有降糖活性的主要成分，對(duì)α-葡萄糖苷酶有明顯抑制作用[7]，與阿卡波糖效果相當(dāng)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于木姜葉柯中三葉苷提取、分離報(bào)道較少，且大多采用乙醇水溶液進(jìn)行提取[13-14]。本試驗(yàn)中以水提取，相對(duì)于乙醇更環(huán)保。

傳統(tǒng)的重結(jié)晶溶劑多采用甲醇，毒性很大，在使用過(guò)程中，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)影響較大，經(jīng)消化道、呼吸道或皮膚攝入都會(huì)產(chǎn)生毒性反應(yīng)，特別是甲醇蒸氣對(duì)呼吸道黏膜和視力損傷很大。本試驗(yàn)中采用乙醇進(jìn)行熱飽和結(jié)晶，得到三葉苷的純度高，污染小，水分量小，經(jīng)碳譜、氫譜、薄層色譜鑒定均為正品。

綜上所述，該方法可用于三葉苷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步研究。