Tfh、IL-21與抗血小板自身抗體檢測在CITP中的意義*

楊自華,張婕婕,何桂蓉,宋 麗

(深圳市人民醫院檢驗科，廣東深圳 518020)

慢性特發性血小板減少性紫癜(CITP)又稱慢性免疫性血小板減少癥，其病程持續時間大于或等于12個月，是一種發病機制尚未明確的自身免疫性疾病，常伴有抗血小板自身抗體及血小板減少等特征，除了體液免疫因素外，細胞免疫因素在其發病中發揮著重要的作用。目前，自身抗體與Tfh細胞的數量變化及其分泌的重要效應細胞因子IL-21的異常表達，在免疫性血小板減少癥的研究中廣受關注[1-5],本研究擬通過觀察CITP患者血液中濾泡輔助性T細胞(Tfh)細胞數量變化及其分泌的重要效應細胞因子IL-21的水平，與自身抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPIb/Ⅸ血小板抗體的表達情況，初步探討其與CITP的發病機制的關系與臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取CITP患者30例作為CITP組，男12例、女18例，年齡15～65歲，中位年齡為40歲，為2016年2月至2018年3月于本院住院的患者。所有受試者均符合慢性ITP的診斷標準[6]。測試前一個月所有患者禁止使用影響試驗結果的相關藥物，如糖皮質激素、細胞毒藥物等，采血前24 h嚴格禁藥，均不伴有高血壓、糖尿病及結核等慢性感染性疾病，血小板計數為(1～32)×109/L。另外，選取本院健康體檢者30例作為對照組，男女各15例，年齡18～56歲，中位年齡39歲，均無腫瘤與自身免疫性疾病，血小板計數為(156～322)×109/L。

2 結 果

2.1CD4+T細胞及CD4+T細胞中CXCR5+CD4+T細胞比例檢測 經流式細胞術檢測,CITP組與對照組CD4+T細胞比例分別為(32.5±0.12)%、(33.3±0.13)%，差異無統計意義(P>0.05)；但CITP組外周血中CXCR5+CD4+T細胞占CD4+T細胞的比例明顯高于對照組， 差異有統計學意義(t=3.695，P<0.05)，見表1。

表1 兩組間CD4+T細胞及CD4+T細胞中CXCR5+CD4+T細胞比例

注：*P<0.05，與對照組比較

2.2IL-2、血小板膜糖蛋白特異性抗體的檢測 CITP組IL-21水平[(183.0±36.2)pg/mL]高于對照組[(126.0±24.9) pg/mL]，差異有統計學意義(t=2.461，P<0.01)。30例CITP患者中出現抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPIb/Ⅸ抗體陽性例數分別為14例(46.7%)和13例(43.3%)。與對照組比較，CITP組血小板特異性抗體(抗GPⅡb/Ⅲa與 GPIb/Ⅸ抗體)陽性者A值更高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3血漿IL-21水平與血小板膜糖蛋白特異性抗體的相關性分析 IL-21與抗GPⅡb/Ⅲa 、抗GPIb/Ⅸ抗體水平進行相關性分析，r分別為0.686和0.395，IL-21水平與抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPIb/Ⅸ抗體呈正相關。

表2 血清IL-21的表達水平及血小板自身抗體A值檢測結果比較

注：*P<0.05，與對照組比較

3 討 論

目前，國內外學者對CITP的研究常集中于T細胞亞群或有關細胞因子的研究，在其發病機制研究中，有學者通過對T細胞亞群分化中參與的效應細胞因子，如IL-21活化的有關基因表達與關鍵蛋白分析，發現其在急性特發性血小板減少性紫癜或CITP中具有鑒別診斷意義[8-9]。也有學者對CTIP患者中血小板減少的原因進行分析，但其減少的機制并沒有完全明確[10]。近年來，學者們普遍認為，CITP患者體內存在一種或多種抗血小板自身抗體，其可以與血小板表面靶向抗原相結合，在不同程度上激活單核巨噬系統，進而導致血小板破壞，致使其數量減少[11]。筆者推測，與健康人群相比，CITP患者Tfh細胞的數量與比例上可能存在著差異，其細胞因子、抗血小板自身抗體出現了異常。

Tfh是新近報道的一種CD4+T細胞亞群，其分子表型為 CXCR5+CD40L+ICOS+，在Tfh自分泌或外分泌的IL-21共同作用下，促進 B細胞增殖、分化以及免疫球蛋白的類別轉換[12]。本研究表明，相較于健康人群，CITP患者Tfh細胞比例明顯增加，這與有關學者的研究基本一致[13]，有研究還發現CITP患者Tfh細胞的過度活化與血小板數量呈負相關，阻斷Tfh細胞活化路徑可對CITP的治療產生作用，因此推測Tfh細胞在CITP疾病過程中可能也發揮了免疫調節作用。研究表明，與對照相比，有著高表達的ICOS與PD-1的CXCR5+CD4+Tfh的比例在患者中顯著增高,進而表明，Tfh細胞主要定位于異位生發中心(GC)，不僅表達CXCR5，也表達PD-1、ICOS、CD40L等效應分子，并具有相對特異的轉錄調控因子BCL-6，以及行使功能的主要產物IL-21[14]。本研究中，CITP患者血液中 CXCR5+CD4+T細胞在CD4+T細胞中的比例明顯高于對照組，說明Tfh在CITP患者存在高表達，提示Tfh可能在CITP患者在病理狀態下有異常增殖表現。此外，本研究還發現CITP組IL-21的水平高于對照組，提示IL-21 的水平可能影響Tfh細胞的分化，間接導致了T細胞介導的慢性自身免疫性疾病的發生。有文獻報道，IL-21能維持GC中B細胞存活和增殖，誘導抗體類別轉換和免疫球蛋白的產生[15]，結合本研究中CITP患者Tfh細胞比例明顯增加，IL-21濃度明顯升高的結果，筆者推測Tfh細胞及IL-21可能參與CITP的發病過程。

針對CITP患者，血小板膜表面糖蛋白(GP)抗體(GPⅡb/Ⅲa或GPIb/Ⅸ)的研究是一大熱點,本研究通過改良MAIPA法，對GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ特異性抗體進行檢測，發現其A值均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。結合先前的研究，筆者推測：在CITP患者中Tfh細胞數量的增加與過度活化，可引起細胞免疫失衡，導致大量血小板自身抗體產生，從而引發血小板破壞增加、數量減少。通過本研究，相對健康人群，CITP患者可能存在Tfh細胞的異常，在Tfh自分泌或外分泌的IL-21共同作用下，抗血小板特異性自身抗體可能參與CITP發生發展過程。

目前,CITP尚無可供應用的“金標準”以明確其診斷，大部分為排除性診斷,客觀上需要排除自身免疫性疾病和其他原因所致繼發性血小板數量降低或血小板功能不足才能診斷。針對CITP患者，血小板膜表面糖蛋白(GP)抗體(GPⅡb/Ⅲa或GPIb/Ⅸ)的研究是一大熱點,其檢測方法主要有微流控技術、單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(如MAIPA)或者放射免疫微球技術等。本研究通過改良MAIPA法，對GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ特異性抗體進行檢測，發現其A值均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。結合先前的研究，筆者推測：在CITP患者中，Tfh細胞數量的增加與過度活化，可引起Tfh細胞免疫失衡，導致大量血小板自身抗體產生，從而引發血小板破壞增加、數量減少，通過Tfh細胞分泌的重要效應細胞因子IL-21與血小板特異性自身抗體(GPⅡb/Ⅲa或GPIb/Ⅸ)相關性分析，證明兩者存在密切聯系，提示CITP中IL-21的異常表達與血小板特異性自身抗體是并存的，只不過GPⅡb/Ⅲa或GPIb/Ⅸ性質不同，可能因為其來源于不同蛋白質家族，破壞血小板的途徑不同，其相關性也就不同，其對于CITP的發病機制研究具有積極意義。

綜上所述，本實驗研究探討了CITP患者Tfh細胞的變化、效應細胞因子IL-21的水平及與血小板特異性自身抗體相關性，結果表明，這些因素的參與提示其可能與CITP的發病機制有關，其可為臨床診斷與治療提供一種思路。