膿毒癥患者血清來源外泌體對巨噬細胞向M1型極化的影響

胡 雷，李永念，祝麗麗，羅昭遜

(1.貴州醫科大學基礎醫學院，貴州貴陽 550003；2.貴州醫科大學兒科學院，貴州貴陽 550004)

膿毒癥是由重度感染引起的臨床綜合征，常伴有多種器官功能受損，具有較高的病死率。健康者的免疫和生理反應可以有效地殺傷病原體，這些功能的失調會導致膿毒癥的發生，而持續的中性粒細胞、單核/巨噬細胞的活化會加速這個過程。另外，淋巴細胞共刺激分子的表達增多、淋巴細胞凋亡的加速、中性粒細胞凋亡的延遲以及組織細胞壞死的增強均是膿毒癥形成的重要機制[1]。單核細胞協同其他吞噬細胞(包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞和自然殺傷細胞)共同構成人體的固有免疫系統，它們是機體對抗病原體的第一道防線[2-3]。機體受到寄生蟲或者細菌感染時，特別是在經典的Ⅰ型炎癥環境中，在促炎癥因子干擾素(IFN)和腫瘤壞死因子(TNF)等的刺激下，骨髓中的單核細胞會進入血液或者其他組織中，分化為經典活化M1型巨噬細胞，并且常高表達一氧化碳合酶(iNOS)[4]。而在Ⅱ型炎癥環境中(如線蟲感染或手術后)，在炎癥因子IL-4 、IL-13等的刺激下，組織原位的巨噬細胞不依賴骨髓來源的單核細胞而自行增殖分化為選擇性活化的M2型巨噬細胞，這類細胞高表達精氨酸酶1[5-6]。外泌體是細胞分泌的囊狀微泡，其內包裹大量蛋白、脂類、微小RNA、mRNA、DNAs，用于細胞間信息傳遞和分子轉運。外泌體主要通過調節抗原提呈、活化或抑制免疫細胞、影響免疫監督和細胞間通訊等方式發揮免疫調節功能[7-9]。而外泌體在膿毒癥形成過程中的作用還鮮有報道，特別是其是否影響單核巨噬細胞的極化而發揮其免疫調控作用還不清楚。本研究通過收集膿毒癥患者血液中的外泌體，并用其刺激人單核細胞系的U937細胞，觀察其是否影響細胞的極化，旨在闡明外泌體在膿毒癥形成過程中的作用提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年1月至2017年12月貴州醫科大學附屬醫院ICU收治的膿毒癥患者23例納入研究，男16例、女7例，抽取每位患者血液5 mL用于外泌體的提取。患者均知情同意并簽署知情同意書。上述患者均有明顯高熱和顯著的白細胞、炎性反應指標升高，均有致病菌感染，均符合膿毒癥診斷標準[1]。納入標準：(1)年齡≥ 18歲；(2)體溫>38 ℃或<36 ℃ ；(3)心率>90 次/分 ；(4)患者呼吸頻率>20 次/分；(5)WBC>12×109/L或<4×109/L。排除標準：(1)伴有惡性腫瘤或免疫缺陷疾病；(2)伴有慢性腎衰竭；(3)伴有急慢性心功能衰竭；(4)伴有血液系統疾病；(5)入院48 h內死亡或者出院的患者。另外，選取23例同期于該院進行體檢且年齡匹配的健康體檢者作為對照，用同樣的方法抽取5 mL血液標本備用。

1.2儀器與試劑 U937細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMSO、LPS和TRIzol均為Invitrogen公司產品，佛波酯(PMA)為MCE公司產品；細胞培養采用的RPMI 1640培養基和無外泌體血清均為Gibco公司產品；ReverTra Ace 實時熒光定量PCR(qPCR)反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑均為TOYOB公司產品；重組人白細胞介素(IL)-4 蛋白、兔抗CD63抗體、兔抗CD9抗體、人IP-10 ELISA 試劑盒 (CXCL10)、人TNF-α ELISA 試劑盒、人 IL-1β ELISA 試劑盒、人腫瘤生長因子(TGF)-β ELISA試劑盒均為Abcam公司產品；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE蛋白凝膠試劑盒均購自碧云天生物技術公司；ECL發光試劑盒為美國millipore公司生產；HRP標記的羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術有限責任公司；血清總外泌體提取試劑為Invitrogen公司產品。低溫離心機為Eppendorf公司5810R型；-80 ℃低溫冰箱為青島海爾公司DW-86L626型；倒置顯微鏡為Nikon公司TS100型；酶標儀為Bio-rad公司680型；凝膠成像儀為ChemiScope公司5600型和qPCR儀為Bio-Rad 公司iQ5型。

1.3方法

1.3.1細胞培養 U937細胞用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中進行培養，每隔1 d換液，每3 d進行一次傳代。用PMA(濃度為100 ng/mL)誘導U937細胞12 h，使其向巨噬細胞分化，以加入同體積的DMSO作為對照；在此基礎上分別用LPS(濃度為100 ng/mL)誘導48 h，使其向M1型巨噬細胞分化，或者用IL-4(濃度為20 ng/mL)誘導48 h，使其向M2型巨噬細胞分化；并在PMA刺激后分別用健康者人和膿毒癥患者來源的外泌體(濃度為0.1 μg/mL)刺激細胞48 h。

1.3.2外泌體的提取與鑒定 將收集的血液室溫下靜置30 min，在4 ℃離心機1 200×g離心15 min,分裝于1.5 mL EP管中,儲存于-80 ℃冰箱備用。根據血清總外泌體提取試劑盒操作步驟提取外泌體，用碧云天BCA蛋白定量試劑盒定量后，一部分用PBS重懸用于刺激細胞，另一部分用Western blot的方法檢測CD63和 CD9的表達，一抗稀釋1 000倍，二抗稀釋3 000倍。

1.3.3Real-time PCR 通過TRIzol裂解細胞，并提取總RNA。用ReverTra Ace qPCR反轉錄試劑盒合成cDNA，并按照SYBR green試劑的實驗步驟進行PCR反應。所有目的基因表達量以GAPDH的表達量作為內參，所有目的基因的表達均消除各自內參后得到相對循環閾值(Ct值)，即ΔCt，若要做A與B兩組某種基因表達的比較，即A是B的2-(ΔCtA-ΔCtB)倍。引物序列如下,CD68正向：5′-AGG CTG TGG GTG GGA TCA-3′，CD68反向:5′- CTT GGA AAG GAG GAA ATG AAA GTC-3′；CXCL10正向:5′-TTC CTG CAA GCC AAT TTT GTC-3′，CXCL10反向:5′-TCT TCT CAC CCT TCT TTT TCA TTG T-3′；TNF-α正向:5′-GCA GGT CTA CTT TGG GAT CAT TG-3′，TNF-α反向:5′-GCG TTT GGG AAG GTT GGA-3′；IL-1β正向:5′-TCA GCC AAT CTT CAT TGC TCA A-3′，IL-1β反向:5′-TGG CGA GCT CAG GTA CTT CTG-3′；CD206正向:5′-CGC TAC TAG GCA ATG CCA ATG-3′，CD206反向:5′-GCA ATC TGC GTA CCA CTT GTT TT-3′；TGF-β正向:5′-CGC GTG CTA ATG GTG GAA A-3′，TGF-β反向:5′-GCT GTG TGT ACT CTG CTT GAA CTT GT-3′；GAPDH正向:5′ -CTT AGC ACC CCT GGC CAA G-3′，GAPDH反向:5′ -GAT TCT GGA GAG CCC CG-3′。

1.3.4ELISA U937細胞經PMA誘導12 h后，再分別進行IL-4、LPS、健康者血清外泌體和膿毒癥患者外泌體刺激48 h，收集培養上清，按照Abcam公司ELISA檢測試劑盒說明書實驗步驟檢測 CXCL10、TNF-α、IL-1β和 TGF-β的水平。

1.4統計學處理 用統計分析軟件SPSS17.0進行處理，多組間實驗數據的比較使用單因素方差分析，兩組間的比較用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PMA誘導U937細胞向巨噬細胞樣細胞分化 U937細胞是懸浮細胞，經PMA誘導后，大量細胞黏附在培養板底，并有一些細胞長出小的突起，見圖1A，且PMA誘導促使巨噬細胞標記分子CD68的mRNA表達明顯增加，見圖1B，表明PMA可誘導U937細胞向巨噬細胞樣細胞分化。

2.2外泌體的鑒定 從健康者與膿毒癥患者血清提取的外泌體，經PBS重懸后BCA法進行蛋白定量，取10 μg總蛋白，提取的外泌體均明顯表達CD63和CD9這兩個外泌體的分子標記，見圖2。

2.3膿毒癥患者來源外泌體對U937-巨噬細胞樣細胞形態學的影響 LPS促使U937-巨噬細胞樣細胞有更多的突起生成，IL-4對U937-巨噬細胞樣細胞的形態無明顯影響，膿毒癥患者來源外泌體也明顯地促使U937-巨噬細胞樣細胞的突起生成，這與LPS誘導后的細胞形態相似，而健康者血清來源的外泌體無這種功能，見圖3。這表明膿毒癥患者來源的外泌體具有M1型巨噬細胞誘導劑相似的功能。

圖1 PMA誘導U937細胞向巨噬細胞樣細胞分化(×200)

圖2 健康者人和膿毒癥患者血清來源的外泌體表達CD63和CD9

圖3 不同因素刺激下U937-巨噬細胞樣細胞的形態學變化

注：*表示P<0.05圖4 膿毒癥患者來源的外泌體促使U937-巨噬細胞樣細胞中CXCL10、TNF-α、IL-1β的轉錄

2.4膿毒癥患者來源外泌體促進U937-巨噬細胞樣細胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的轉錄 qPCR 檢測M1型巨噬細胞標記分子(CXCL10、TNF-α、IL-1β)和 M2型巨噬細胞標記分子(CD206、TGF-β)在mRNA水平的表達發現，LPS促使巨噬細胞樣細胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的表達增加，IL-4促使巨噬細胞樣細胞CD206、TGF-β的表達增加，膿毒癥患者來源的外泌體也明顯地促使CXCL10、TNF-α、IL-1β表達的增加，這與LPS的效應相似，而健康者血清來源的外泌體無這種功能。見圖4。

2.5膿毒癥患者來源外泌體促進U937-巨噬細胞樣細胞分泌CXCL10、TNF-α、IL-1β LPS使巨噬細胞樣細胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌增加，IL-4使巨噬細胞樣細胞TGF-β的分泌增加，膿毒癥患者來源的外泌體也促進了CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌，這與LPS有相似的功能，而健康者來源的外泌體無這種功能。這表明膿毒癥患者來源的外泌體可促使巨噬細胞樣細胞向M1型極化。見圖5。

注：*表示P<0.05圖5 膿毒癥患者來源的外泌體促使U937-巨噬細胞樣細胞中CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌

3 討 論

膿毒癥目前仍是重癥醫學領域面臨的重大難題，每年都有大量患者因此死亡[10]。有研究針對全球37個國家超過11 000名膿毒癥患者的資料進行匯總，結果發現有57%的患者是革蘭陰性菌感染，有44%的患者是革蘭陽性菌感染，11%的患者是真菌感染[11]。可見，膿毒癥往往是由病原體感染引起的，這些病原體感染后引發的免疫應答可能是導致多種臨床癥狀的主要原因，抑制病原體和減弱由病原體感染誘導的免疫應答是緩解膿毒癥的重要手段。

巨噬細胞因其功能狀態不同，可分為M1和M2型。M1型巨噬細胞高表達CXCL10、TNF-α和IL-1β(可作為M1型巨噬細胞的分子標記)[12]。巨噬細胞吞噬細菌后會產生一系列炎癥因子，進而激活固有免疫系統來抵御細菌的侵襲[1]，此時的巨噬細胞為M1型。M2型巨噬細胞具有抗炎功能，表現為高表達甘露醇受體CD206和TGF-β[13]。IL-4能促進巨噬細胞CD206的表達增加[14-15]。在疾病發生過程中，巨噬細胞的極化程度取決于其所處的組織微環境[16]。在膿毒癥的發生過程中，病原體的持續存在會過度活化體內免疫細胞，導致免疫應答的持續活躍。巨噬細胞作為免疫應答中的重要一環，其向M1型轉變會加重膿毒癥。

細胞釋放的外泌體中含有豐富的蛋白、脂類、microRNA和mRNA，通過這些物質的轉運來發揮細胞間信息傳遞的作用，大量研究表明其也具有調控免疫應答的功能[7]。外泌體因其來源的細胞及所處的微環境不同而發揮不同的免疫調節作用。細菌感染的巨噬細胞來源的外泌體具有明顯的免疫調節作用，其具有刺激巨噬細胞和中性粒細胞高表達TNF和iNOS的作用[17]，而且這些外泌體還可增強機體免疫監視的功能[18]。另外，CD4+T細胞來源的外泌體能促進T細胞的活化[19]。成熟樹突細胞來源的外泌體可通過TNF信號途徑活化免疫反應[20]。相對于以上提到的外泌體所具有的促進免疫應答和炎性反應的作用來說，腫瘤細胞來源的外泌體具有抑制免疫應答和炎性反應的作用[21]。腫瘤細胞來源的外泌體可以有效抑制T細胞和NK細胞活性，并活化粒細胞來源的抑制細胞來發揮免疫抑制作用[22-23]。此外，黑色素瘤細胞外泌體內包裹的Fas配體能通過促進淋巴細胞的凋亡來抑制免疫應答[24]。而在膿毒癥形成過程中，體內的免疫細胞可能也會受到外泌體的影響而發生功能狀態的改變，從而加劇膿毒癥的進程。

在本研究中，為了判斷膿毒癥患者來源外泌體對巨噬細胞功能的影響，本課題組首先用PMA誘導人U937單核細胞向巨噬細胞樣細胞分化[25]，結果發現PMA促使懸浮生長的U937細胞貼壁生長，并長出小的突起，具有了巨噬細胞樣的形態特征，而且巨噬細胞的標記分子CD68也表達增加。在此基礎上，本課題組采用健康者血清與膿毒癥患者來源的外泌體刺激PMA誘導后的U937細胞，并以健康者來源外泌體、IL-4或者LPS刺激作為對照，結果發現IL-4誘導的細胞可有效表達M2型巨噬細胞的標記分子，LPS誘導的細胞可高表達M1型巨噬細胞標記分子，膿毒癥來源的外泌體具有與LPS相似的功能，也促進PMA誘導的U937細胞高表達M1型巨噬細胞標記分子，而健康者血清來源的外泌體卻沒有這種功能。

4 結 論

膿毒癥來源的外泌體具有促進巨噬細胞向M1型極化的作用，為外泌體在炎癥疾病發生中的作用增加了實驗依據，提示外泌體誘導的巨噬細胞向促炎癥表型分化可能是膿毒癥形成的一種病理機制，也為膿毒癥的防治提供了一定的理論基礎。