使用GC/MS和GC-O鑒定皖南煙葉主要呈香組分

倪 偉 ， 陳開波 ， 徐志強 ， 徐迎波 ， 周志磊 ， 毛 健 *

（1.安徽中煙工業有限責任公司 煙草化學安徽省重點實驗室，安徽 合肥230088；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫214122）

特色煙葉的開發是我國烤煙生產發展的重要方面，“焦甜香”近年來受到消費者和煙草行業的重視，其獨特的香氣十分適合生產中式卷煙的需求。皖南煙葉具有焦甜香的風格，表現為煙葉的香氣濃郁，回甜感較強，香氣濃郁，透發性好，具有濃香型的同時兼具焦甜香，是開發焦甜香型卷煙的理想材料。

煙葉香氣和香氣成分一直是煙草領域研究的熱點之一，焦甜香是烤煙的典型香氣之一。國內外研究人員對卷煙的焦甜香組分進行了探索。Matsukura等[1]通過柱層析對煙葉烘焙揮發物進行了分析，檢測到了甲基環戊烯醇酮、麥芽酚、菠蘿酮等幾種具有焦甜香的成分。張啟東等[2]分析了主流煙氣粒相物水溶性組分中烤甜香成分，認為呋喃類、環戊烯酮類、呋喃酮類和吡喃酮類化合物對烤甜香有直接貢獻。這些化合物均具有烯醇化平面結構單元，這種結構的化合物通常具有焦甜特征風味

[3]。通過分析化學成分與感官評分之間的相關性尋找香氣的主要貢獻物質是研究人員常用的方法之一。薛超群等[4]使用逐步回歸分析了煙葉理化指標與焦甜感程度的相關性，發現糠醛、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃、香葉基丙酮是影響焦甜感程度的主要指標。一些研究人員探究了品種、氣候條件、土壤、以及施肥等因素對皖南烤煙焦甜香的影響[5-9]。但是，總體來說人們對于皖南煙葉香氣的主要貢獻組分依然不明確。對于復雜基質，香氣由多個化學組分貢獻。如何在眾多的化學成分中找出主要呈香組分是風味化學研究的熱點和難點。氣相色譜-質譜/嗅覺測量法（GC-MS/O）是解決這個問題的有效手段之一。在色譜流出物進質譜分析的同時以人的鼻子做為檢測器，對流出峰進行氣味特征和強度評價。它有效結合了氣質聯用儀高效分離、定性和定量的優勢以及人鼻子靈敏度高的優勢，可以幫助人們從復雜的混合物質中篩選出對香氣有重要貢獻的組分。

GC-O在食品、環保、醫學、香妝品化學等多個領域應用廣泛。但是目前其在煙草研究中的應用很少，僅有寥寥數篇文獻。Higashi等[10]使用GC-O和預濃縮技術分析了卷煙側流煙氣的VOC，鑒定出30多個香氣成分。Bazemore等[11]使用頂空固相微萃?。℉S-HPME）和GC-O分析了雪茄消費者呼出的氣體中的香氣物質，發現吡啶類和吡嗪類物質是主要的呈香物質。隨后Cotte等[12]建立了使用GC-O分析卷煙煙氣的方法，鑒定了6個關鍵的呈香物質。國內研究人員也開始將GC-O用于煙草分析，陳麗君等[13]使用GC-O對煙草精油和津巴布韋煙葉的主要呈香物質進行了鑒定。隨著近幾年煙草行業對香型風格的重視及煙草風味研究的深入[14]，GC-O有望成為幫助研究人員揭示煙草香型和風格差異的重要手段之一。

本實驗作者嘗試采用氣相色譜-質譜/嗅覺測量法（GC-MS/O）對皖南焦甜香煙葉中的主要呈香物質進行鑒定，為客觀的進行焦甜香煙葉的篩選和評價提供借鑒和思考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 煙葉 皖南焦甜香型煙葉，由安徽中煙工業公司提供。

1.1.2 試劑 香味成分標準參照樣：4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、苯乙醛、芳樟醇、β-二氫大馬酮、香葉基丙酮、2-戊基呋喃、β-紫羅蘭酮、苯乙酮、正己醛、苯乙醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、甲基環戊烯醇酮、2-糠醛、苯甲醛、2-甲基四氫呋喃-3-酮、3-羥基-2-丁酮、2，3-戊二酮、二氫獼猴桃內酯、苯甲醛、反式-2-戊烯醛、5-甲基呋喃醛、吡啶、2-乙酰基呋喃、麥芽酚、2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪以及2-乙酰吡咯，內標為2-乙酸苯乙酯，以上試劑均為分析純，購于百靈威科技有限公司（中國，北京）；溶劑為二氯甲烷（色譜純），購自美國Tedia公司；無水硫酸鈉（分析純），購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗中用到的其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

SHZ型水循環真空泵，上海亞榮生化儀器廠制造；Trace ISQ氣質聯用儀，美國熱電公司產品；RE-52AA型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠制造；ODP嗅辯儀，德國 Gerstel公司產品；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（2 cm）及萃取裝置，美國Supelco公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的前處理 煙絲放入烘箱內，在40℃下干燥2 h，粉碎過40目篩。

1）頂空-固相微萃取。取1 g煙末，放入20 mL頂空瓶中，密封后在70℃平衡14 h，然后于相同溫度下吸附60 min，萃取頭為30/50 μm CAR/DVB/PDMS，然后于氣相色譜進樣口250℃解析6 min。

2）同時蒸餾萃取。稱取25.0 g煙末置于SDE裝置一端的1000 mL平底燒瓶中，并向其中加入350 mL飽和NaCl溶液，用調溫電熱器加熱；裝置的另一端接盛有60 mL二氯甲烷的250 mL圓底燒瓶，用 60℃的水浴加熱；調節加熱溫度使水相和二氯甲烷相的餾出速度相等，萃取2.5 h；將二氯甲烷萃取溶液冷卻至室溫，加入適量的無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，濾液中加入 25 μL IS（186 μg/mL），40℃水浴中減壓旋轉蒸發濃縮到1 mL，再氮吹濃縮至0.1 mL進 GC-MS分析[15]。

1.3.2 標準物質的儲備液、校正曲線溶液的制備分別準確稱取一定量的標樣，用二氯甲烷定容于50 mL容量瓶中制備成儲備液。然后分別量取10、25、50、100、200 μL 和 500 μL 儲備液于 50 mL 容量瓶中，加入12.5 mL內標儲備液（使定容后內標質量濃度為46.5 μg/mL），使用二氯甲烷定容，制備成不同濃度梯度的標準物質混合溶液。

1.3.3 GC-MS檢測條件 色譜條件，色譜柱：HPINNOWAX（30 m×0.25 mmi.d.，0.25 μmd.f.）毛細管色譜柱；進樣口溫度：240 ℃；載氣：He；流速：1 mL/min；進樣量：1 μL；分流比 10∶1；升溫程序：從 50 ℃以4℃/min升溫到200℃，再以8℃/min的升溫速率升溫到230℃并保持20 min；電離方式：電子轟擊離子源（EI）；離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：250℃；掃描方式：選擇離子監測（SIM）和全離子掃描（Scan）模式；掃描范圍：50~350 amu；溶劑延遲4 min。采用Nist質譜數據庫檢索結合標準物質進行定性分析，有標樣的物質采用標準曲線定量，沒有標樣的物質忽略響應因子，假定目標物與內標的面積比等于濃度比進行近似定量[15]。

1.3.4 GC-O分析

1）SPME-強度法。使用SPME結合強度法對煙草香氣成分進行評估，2個有經驗的評價員參與實驗，針對煙草香氣物質對評價員進行額外的20個小時培訓（每周4 h，共5周）。分析時，評價員對每個色譜峰進行嗅聞分析，進行香氣特征和強度評價，5分代表非常強，4分代表比較強，3分代表中等強度，2分代表比較弱，1分代表很弱。

2）GC-O 和香氣提取稀釋分析（AEDA，aroma extract dilution analysis）。使用SDE處理的煙草樣品進行AEDA分析，將樣品按以下倍數進行梯度稀釋：2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍…。記錄每一個流出峰能夠聞到氣味的最小濃度（最大稀釋倍數），即為該物質的稀釋因子（FD）。

1.3.5 閾值測定 使用三點檢驗法測定單個物質的閾值，參照國標GB/T 12311-2012《感官分析三點檢驗》進行實驗，使用純水做參照樣，將香氣物質的稀溶液和參照樣用三位隨機數字編碼，每3個杯子為1組，2組樣品一起呈送給評價員，評價員需判定3個杯子中氣味最強的一個，最終通過統計正確率得到閾值，評價員人數為32人。

1.3.6 數據的處理與分析 所有樣品至少測定2個平行，結果以平均值±標準偏差的形式表示。方差分析（ANOVA）使用IBM SPSS19.0軟件進行處理。

2 結果與討論

2.1 使用GC/MS和GC-O分析皖南煙葉主要呈香組分

目前煙葉香氣成分提取常用的方法是SDE，該法可以有效將香氣物質從煙葉中提取出來，樣品較干凈，雜質少，該法的主要缺點是制樣過程中需要長時間的加熱過程，容易生成人工副產物。SPME是一種近年來發展起來的高效檢測方法，制樣簡單，靈敏度高，受到研究人員的重視。但是該法對香氣物質的富集程度不如SDE，不利于評價員在GC-O分析中評價色譜流出峰的香氣。因此本研究使用SDE和HS-SPME 2種方法提取香味成分，結合GC-O對皖南煙葉主要呈香組分進行鑒定。

表1 皖南煙葉SDE樣品GC/MS和GC-O分析結果Table 1 GC/MS and GC-O analysis results of tobacco leavesfrom southern Anhui extracted with SDE

續表1

由于SDE法制備的樣品為溶液，選擇香氣提取稀釋分析法（AEDA）進行GC-O分析，使用稀釋因子（FD）表示每個物質的香氣強度[16]。表1顯示了SDE法煙葉香氣物質GC/MS和GC-O分析的結果，共檢測到了35個物質，其中26個物質能感受到香氣。把稀釋因子大于等于16的香氣物質認定為主要香氣物質，得到了7個主要呈香物質，包括：2-戊基呋喃、2-甲基-4氫呋喃-3-酮、2-糠醛、苯乙醛、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮以及巨豆三烯酮。其中香氣強度最大的是β-紫羅蘭酮。SDE法樣品制備需要高溫長時間的加熱過程，可能會有人為副產物生成，比如2-糠醛和2-甲基四氫呋喃-3-酮是糖裂解和美拉德反應的重要產物，二者的含量有可能被高估，因此有必要采用其他方法進行分析驗證。

HS-SPME法的原理是將香氣物質吸附在萃取頭上進行富集再于氣相進樣口解吸附，因此不方便進行梯度稀釋，在進行GC-O分析時，強度法是比較合適的選擇，使用有經驗的評價員對色譜流出峰進行香氣特征和香氣強度的評價[16]。表2顯示了使用HS-SPME法提取煙葉香氣物質的GC/MS-O分析結果，共檢測到了36個物質，其中22個物質可以感受到氣味，除了吡啶和己酸產生了令人不悅的氣味外，其他物質均產生了令人愉悅的香氣。共有10個物質的香氣強度超過了3.0，包括：2-糠醛、芳樟醇、苯乙醛、茄酮、2-乙酰吡咯、麥芽酚、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮和二氫獼猴桃內酯。其中香氣強度最高的是香葉基丙酮和二氫獼猴桃內酯。與SDE法相比，HS-SPME法鑒定了更多的主要香氣物質，其中2-糠醛、苯乙醛、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮和巨豆三烯酮被2種方法鑒定為主要香氣物質，說明這幾種香氣物質可能對皖南煙葉的香氣有重要貢獻。

表2 皖南煙葉HS-SPME樣品GC/MS及GC-O分析結果Table 2 GC/MS and GC-O analysis results of tobacco leaves from southern Anhui extracted with HSSPME

2.2 使用香氣重組法驗證皖南煙葉主要香氣組分

前面使用GC-MS結合GC-O得到了皖南焦甜香煙葉中的主要呈香組分，這種方法可以得到不同物質對煙葉香氣的貢獻大小，也評估了單個物質的香氣特點。但是煙葉中含有多種香氣物質，實際上這些物質之間可能存在復雜的相互作用，使用GCO也不能評估樣品基質對香氣物質的影響。因此，需要使用風味重組法對前述研究得到的主要香氣組分進行驗證，同時探討每個香氣物質在基質背景下對煙葉總體香氣的影響。因此首先對前面得到的重要香氣物質進行定量分析，一些標準物質的校正曲線參數如表3所示。

表3 皖南煙葉香氣物質校正曲線參數Table 3 Calibration curves，correlation coefficients and linearity rangefor aroma compounds oftobacco leaves fromsouthern Anhui

由于煙葉為固體，在實際基質或者模擬體系下評估每個香氣成分的貢獻是比較困難的。本文中的閾值是香氣物質在水溶液中的閾值，與實際體系可能會有偏差，但是這并不妨礙我們評估各個香氣物質對煙葉香氣的貢獻大小。得到香氣物質的質量分數之后，使用香氣活度值（OAV，香氣物質質量分數與閾值的比值）表征單個物質的香氣貢獻大小。表4列舉了皖南煙葉香氣物質的的質量分數、閾值和香氣活度值（OAV），OAV值大于1的物質共有14個。其中OAV值最高的物質為4-乙烯基愈創木酚，苯乙醛、芳樟醇、β-二氫大馬酮、香葉基丙酮、2-戊基呋喃以及β-紫羅蘭酮的OAV值也比較高。這些物質均能產生令人愉悅的香氣，4-乙烯基-2甲氧基苯酚能產生一種丁香、木香的香料味，而苯乙醛，芳樟醇，β-二氫大馬酮、香葉基丙酮以及β-紫羅蘭酮均能產生甜的果香，它們可能也對皖南煙葉的焦甜香有一定的貢獻。2-戊基呋喃、甲基環戊烯醇酮和2-糠醛能產生焦甜香、面包香、烘烤香，他們可能是皖南煙葉焦甜香的重要貢獻物質。此外巨豆三烯酮和茄酮沒有得到商業可用的標樣，無法通過感官方法對其進行驗證和評價。但是GC-O實驗中AEDA和強度法均發現二者有較強的香氣強度，因此可以斷定二者也是皖南焦甜香煙葉香氣的重要貢獻者。

表4 皖南煙葉香氣物質質量分數、閾值及香氣活度值Table 4 Content，threshold，and odor activity values of aroma compounds of tobacco leaves from southern Anhui

3 結 語

GC-MS/O是鑒定食品呈香組分的有效手段之一，本研究表明其在煙葉呈香組分鑒定方面也有較好的應用效果。本文作者結合GC/MS、GC-O和感官分析（閾值測定、香氣活度值測定）鑒定了皖南煙葉的呈香組分，得到了16個主要呈香組分，除了茄酮和巨豆三烯酮由于沒有商業標品無法驗證外，其他呈香物質對皖南煙葉香氣的貢獻都得到了驗證。本文是結合化學分析與感官分析方法對煙葉香氣進行鑒定的初步探索，將來還需要進一步通過返添加或者模擬缺失實驗確定單個香氣物質對煙葉具體香氣屬性或者香型的貢獻規律。