大種量流加式高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵工藝的研究

吳 杰 ， 王 團 ， 王 柯 ， 張建華 *

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

我國從2002年起開始大力發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)，生產(chǎn)技術不斷提高，產(chǎn)量也已躍居為全球第三位[1]。但是，常濃度乙醇生產(chǎn)工藝存在發(fā)酵濃度低，能耗高和設備利用率低，污染嚴重等問題，制約了行業(yè)的發(fā)展[2]。而高濃度乙醇發(fā)酵 （Very high gravity，VHG）工藝的提出有望解決這些問題[3]。該工藝可有效提高設備利用率和生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)能耗和廢水處理負荷[4]。

在實際生產(chǎn)應用中，乙醇發(fā)酵主要采用間歇式工藝，發(fā)酵的酒度一般在10%~11%（體積分數(shù)）。簡單提高發(fā)酵酒度的后果是殘?zhí)巧仙?，淀粉利用率下降。由于乙醇生產(chǎn)中，原料成本占直接生產(chǎn)成本的80%以上，淀粉利用率降低直接導致乙醇生產(chǎn)經(jīng)濟效益降低，這也是國內(nèi)乙醇高濃度發(fā)酵一直沒有能夠很好推廣的主要原因。造成殘?zhí)巧仙?，淀粉利用率下降的主要原因是，發(fā)酵前期的高濃度底物（葡萄糖）和發(fā)酵后期的高濃度產(chǎn)物（乙醇）會對釀酒酵母產(chǎn)生抑制作用，降低釀酒酵母吸收營養(yǎng)的能力。另外，高濃度乙醇還會改變酵母的細胞膜結構及其通透性，導致發(fā)酵延遲或者提前終止，進而造成殘?zhí)歉?、淀粉利用率低[5-7]。因此，學者們主要從酵母改造和工藝優(yōu)化2個方面來解決這一問題。申乃坤等

[8]通過單因素實驗確定主要因素為淀粉酶用量、底物濃度、初始發(fā)酵pH，并采用響應面優(yōu)化研究主要因素的相互影響，并通過對發(fā)酵溫度進行梯度降溫，最終使發(fā)酵后酒度在16.24%（體積分數(shù)），殘總糖控制在18.8 g/L。唐艷艷等[9]在研究高濃發(fā)酵過程發(fā)現(xiàn)，采用先糖化再發(fā)酵工藝會抑制酵母發(fā)酵，提出采用邊糖化邊發(fā)酵工藝有效解決了高濃發(fā)酵糖濃過高問題，發(fā)酵效率明顯提高。LIU等[10]通過向發(fā)酵液中添加水溶性聚乙二醇，發(fā)現(xiàn)該物質可以對酵母形成外保護，達到提高細胞活力和乙醇產(chǎn)量的效果。WANG等[11]通過基因工程改造的手段獲得胞內(nèi)積聚高濃海藻糖酵母菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株在高濃發(fā)酵工程中的細胞活力和發(fā)酵能力明顯高于出發(fā)菌株，并揭示了高濃乙醇發(fā)酵過程中海藻糖對酵母的保護作用。WANG等[12]通過計算獲得了高濃酒精發(fā)酵氮源及其他微量物質的用量。ZHANG等[13]通過響應面優(yōu)化和多元回歸分析降低了以紅薯為原料高濃酒精發(fā)酵醪的粘度。潘豐等[14]通過設計發(fā)酵過程乙醇濃度在線監(jiān)控設備，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度反饋流加方式對于提高發(fā)酵效果有明顯幫助。

我們提出了大種量流加式來解決傳統(tǒng)間歇式高濃度乙醇發(fā)酵工藝存在的問題。該工藝是在間歇式發(fā)酵前期將部分糖液接種培養(yǎng)一定時間，以提高發(fā)酵液中酵母數(shù)量，再流加剩余的糖液，這樣可縮短發(fā)酵體系中酵母生長的延滯期，加快產(chǎn)物合成速度[15]。在流加剩余糖液時，可通過控制流加速度，避免發(fā)酵體系出現(xiàn)糖濃度過高的問題。同時，新鮮的糖液擴大了發(fā)酵體系，降低了發(fā)酵液中的乙醇濃度[16]。本文作者對大種量流加式高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵工藝中的接種量（體積分數(shù)）、初始接種時間、流加時長和流加方式進行了優(yōu)化，獲得了大種量流加式高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵的最優(yōu)工藝，并對其機理作初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母（S.cerevisiae）：湖北宜昌安琪酵母有限公司產(chǎn)品；木薯：江蘇金茂源生物化工有限責任公司產(chǎn)品；耐高溫α-淀粉酶（136000 U/mL）和糖化酶（10000 U/mL）：無錫杰能科生物工程有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純或優(yōu)級純市售商品。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉 8.5，MgSO4·7H2O 0.1，NH4Cl 1.3，CaCl20.06。 培養(yǎng)條件：搖床培養(yǎng)，200 r/min，30 ℃，17.5 h。

木薯培養(yǎng)基：不同料水比的液化液，添加尿素和糖化酶。

基礎培養(yǎng)基 （g/L）： 葡萄糖 50，MgSO4·7H2O 0.75，KH2PO41.7，CaCl20.06。

高糖培養(yǎng)基 （g/L）：葡萄糖質量濃度分別為180、230、260、290 的基礎培養(yǎng)基。

高乙醇培養(yǎng)基（g/L）：乙醇質量濃度分別為0、38、75、110的基礎培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均pH自然，115℃滅菌15 min。

1.2.2 液化液制備 分別按 1∶3、1∶2.7、1∶2.5、1∶2.3、1∶2（g∶L）5 個料水比將木薯粉（過 50 目篩子，平均粒徑0.22 mm）與去離子水混合，用氫氧化鈉或硫酸溶液將料液pH調節(jié)至5.5，加入耐高溫α-淀粉酶（15 U/g木薯粉）。加熱至88℃，維持100 min。冷卻至室溫，添加去離子水補充液化過程水分的損失。

1.2.3 乙醇發(fā)酵 間歇式乙醇發(fā)酵：將不同料水比液化液各取900 mL裝入3 L的三角瓶中，加入糖化酶 （180 U/g木薯粉）、種子培養(yǎng)基 （體積分數(shù)為10%）和尿素（450 mg/L）啟動乙醇發(fā)酵。30℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵50 h。

大種量流加式高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵 （料水比1 g∶2 L）： 分別將 100、200、300 mL 料水比為 1 g∶2 L的液化液分裝到3 L的三角瓶中，加入糖化酶（180 U/g木薯粉）、種子培養(yǎng)基（體積分數(shù)10%）和尿素（450 mg/L），30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 2、8、12 h后，分別將800、700、600 mL 液化液，加入糖化酶（180 U/g 木薯粉）和尿素（450 mg/L），用 10、20、30 h 按勻速，梯度加速，梯度減速3種方式流加到裝有不同體積發(fā)酵液的3 L的三角瓶中。30℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵50 h。

1.2.4 分析方法 還原糖和總糖質量濃度采用采用菲林試劑滴定法測定[17]。糊精質量濃度測定是將發(fā)酵液離心（10000g，10 min），測定上清液中的殘總糖（清液殘總糖）質量濃度，減去發(fā)酵液中還原糖質量濃度即為糊精質量濃度。乙醇、葡萄糖采用高效液相色譜法（HPLC，Dionex，U-3000，USA）測定。色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm，Hercules，CA）；RI 檢測器 （Shodex RI-101，Japan）和UV檢測器 （Dionex，USA）；流動相為5 mmol/L硫酸；柱溫65℃；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL。 樣品預處理：發(fā)酵液離心（10000g，10 min）后，上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾，取濾液用于HPLC分析。酵母細胞數(shù)采用血球板計數(shù)法測定[18]。

2 結果與討論

2.1 不同料水比對間歇式乙醇發(fā)酵的影響

分別用料水比為 1∶3、1∶2.7、1∶2.5、1∶2.3、1∶2 （g∶L）的液化液進行乙醇發(fā)酵，發(fā)酵結果如表1所示。由表1可以看出，隨著拌料質量濃度的增大，乙醇體積分數(shù)明顯上升，但與此同時發(fā)酵結束后的殘總糖質量濃度也隨之增加。當料水比為1 g∶2 L時，酒度高達15.8%（體積分數(shù)），而殘總糖質量濃度也增至22 g/L。通過對殘總糖的構成分析發(fā)現(xiàn)（圖1），隨著拌料質量濃度的增加，殘還原糖和殘糊精也不斷增加。殘還原糖質量濃度的增加說明，隨著拌料質量濃度的增加，發(fā)酵后期酵母活力逐步下降，耗糖能力隨之減弱，這主要是由于在高的拌料質量濃度下，釀酒酵母出現(xiàn)了較強的底物（葡萄糖）和產(chǎn)物（乙醇）抑制作用[18]。殘糊精質量濃度的增加說明，隨著拌料質量濃度的增加，發(fā)酵過程糖化酶的活力降低，抑制了糖化過程。

表1 不同料液比間歇式乙醇發(fā)酵效果Table 1 Effect of different material-water ratio on batch ethanol fermentation

圖1 不同料液比間歇式乙醇發(fā)酵液中，殘還原糖、殘糊精的質量濃度Fig.1 Concentrations of residual reducing sugar and residue dextrin in the batch ethanol fermentation with different material-water ratio

2.2 大種量流加式高濃乙醇發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.2.1 接種量對發(fā)酵的影響 目前，實際生產(chǎn)中主要采用同步糖化發(fā)酵工藝。在高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵過程中，釀酒酵母的延滯期較長，在此過程，料液中糊精被糖化釋放出大量葡萄糖，會抑制釀酒酵母的生長與繁殖。這一問題可通過在發(fā)酵前期添加部分糖液后培養(yǎng)一定時間，作為含有較高酵母數(shù)量的種子來解決。本文作者選擇料水比為1 g∶2 L，將種子分別擴培到發(fā)酵體積的20%、30%、40%，培養(yǎng)8 h后將剩余料液通過10 h勻速流加到發(fā)酵瓶中。發(fā)酵過程及結束后的總糖及還原糖如圖2與表2所示。Puligundla等[18]報道，高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵過程中的高糖質量濃度和高乙醇體積分數(shù)是影響發(fā)酵效果的主要因素，因此應選擇較低的糖質量濃度作為工藝優(yōu)化的目標。當接種量為20%時，初始糖質量濃度很低，但是開始流加糖液后，發(fā)酵液中的糖質量濃度迅速上升。這是因為接種量過小，新流加的糖不能被迅速消耗，造成糖的積累。接種量30%，40%時，發(fā)酵液中總糖質量濃度增長緩慢，但是接種量40%的還原糖質量濃度明顯高于接種量30%的。從糖醇轉化率和殘?zhí)莵砜矗?jīng)過50 h發(fā)酵后，接種量為20%、30%、40%的糖醇轉化率、清液殘總糖分別為 89.1%、90.5%、90.3%和 10.8、8.8、10.3 g/L。 因此，接種量為30%更適合大種量流加式高濃乙醇發(fā)酵過程。

圖2 不同接種量流加發(fā)酵過程中的總糖和還原糖變化情況Fig.2 Changeoftotalsugarand reducing sugar concentration in fed batch ethanol fermentation with different inoculum concentration

表2 不同大種量流加式發(fā)酵工藝對高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵效果的影響Table 2 Effect of different massive inocula fed-batch processes on very high gravity ethanol fermentation

2.2.2 初始流加時間對發(fā)酵的影響 合適的數(shù)量及出芽率的酵母能快速地將發(fā)酵液中的糖轉化為乙醇，確保較高的糖醇轉化率。圖3是在料水比為1 g∶2 L，30%接種量下，酵母培養(yǎng)過程中的酵母數(shù)及出芽率情況。接種后第0~2 h，酵母處于延滯期，酵母增殖緩慢；在第2~10 h，酵母進入對數(shù)生長期，酵母迅速增殖；第10 h后，酵母進入平穩(wěn)期，酵母數(shù)基本維持不變。分別選擇接種后的第2、8、14 h研究初始流加時間對大種量流加發(fā)酵的影響。發(fā)酵過程中總糖及還原糖質量濃度如圖4所示，在接種后2 h開始流加糖液，流加過程中總糖和還原糖一直維持在220 g/L和105 g/L左右。在接種后8 h開始流加糖液，流加前5 h的總糖和還原糖一直維持在150 g/L和75 g/L左右。在接種后14 h開始流加糖液，流加過程中總糖和還原糖分別從75 g/L上升到150 g/L和25 g/L上升到75 g/L。從發(fā)酵效果來看 （表2），初始流加時間為第2、8、14 h下的發(fā)酵后的糖醇轉化率分別為89.8%、90.5%、90%，清液殘總糖分別為10.7、7.2、10.6 g/L。因此，選擇初始流加時間為接種后的第8 h。

圖3 種子培養(yǎng)過程中的酵母數(shù)及出芽率變化情況Fig.3 Change of yeast number and budding rate in the process of seed cultivation

圖4 不同初始接種時間下，流加發(fā)酵過程中的總糖和還原糖變化情況Fig.4 Changeoftotalsugarand reducing sugar concentration in fed-batch fermentation with different initial inoculation time

2.2.3 流加時長對發(fā)酵的影響 接種量為30%，種子培養(yǎng)8 h后，將剩余料液分別通過5、10、20、30 h勻速流加到發(fā)酵體系中。發(fā)酵過程中的糖變化情況及發(fā)酵結果如圖5和表2所示。從發(fā)酵過程中的糖濃度變化情況來看，流加時長為5 h或10 h，總糖出現(xiàn)明顯的積累現(xiàn)象，還原糖維持在100 g/L左右；流加時長為20 h，流加過程中的總糖迅速下降，還原糖也逐步降低，流加結束后的總糖和還原糖在120 g/L和60 g/L左右；流加時長為30 h，在發(fā)酵后期出現(xiàn)糖累積上升的情況。這說明流加時間過長，料液補加較慢，導致酵母在25 h左右處于缺少糖的狀態(tài)，發(fā)酵50 h后酒度和殘?zhí)侨匀缓芨?。從發(fā)酵效果來看，流加時長5、10、20、30 h發(fā)酵后的糖醇轉化率分別為90.2%、90.5%、91.7%、85.5%，清液殘總糖分別11.0、10.6、6.9、13.8 g/L。 因此，選擇流加周期為 20 h最為適宜。

圖5 不同流加時長下，流加發(fā)酵過程中的總糖和還原糖變化情況Fig.5 Changeoftotalsugarand reducing sugar concentration in fed batch fermentation with different feeding duration

2.2.4 流加方式對發(fā)酵的影響 30%接種量，種子培養(yǎng)8 h后，將剩余料液在20 h內(nèi)分別采用勻速、梯度減速和梯度加速流加到發(fā)酵瓶中。其中勻速流加以35 mL/h的速度流加；梯度加速流加按18、27、35、44、53 mL/h 流加；梯度減速速流加按 53、44、35、27、18 mL/h流加，每個流速流加4 h。發(fā)酵過程中的糖質量濃度變化及發(fā)酵結果見圖6和表2。流加發(fā)酵前期，采用勻速和加速流加，總糖質量濃度維持在150 g/L左右。發(fā)酵前期流加速率稍慢，確保補充的糖能被酵母利用。在流加后期，隨著發(fā)酵體系逐漸擴大，此刻流加速度變大不會再導致糖積累。相反的，糖液的快速補充反而可以稀釋發(fā)酵液中的乙醇，從而延緩高體積分數(shù)乙醇對酵母的脅迫作用。而減速流加方式補糖則會糖積累。從表2可知，勻速、加速和減速3種流加方式后的酒度分別為91.7%、91.5%、90.5%， 清液殘總糖分別 6.9、6.9、7.5 g/L。從發(fā)酵過程及發(fā)酵結束后的情況分析可知，流加過程中采用勻速或加速流加策略均適于高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵。但是考慮到操作的簡便性，選擇勻速流加方式更加合理。

2.3 大種量流加式與間歇式高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵工藝對比及優(yōu)勢分析

為了研究大種量流加式與間歇式工藝在高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵中的區(qū)別，本文對2個工藝發(fā)酵過程情況進行對比，結果如圖7所示。大種量流加式工藝按接種量為30%，種子培養(yǎng)8 h后，按勻速流加方式流加20 h。發(fā)酵前20 h，間歇式和流加式發(fā)酵過程中的還原糖質量濃度分別維持在125 g/L和75 g/L。流加式發(fā)酵中的糖質量濃度明顯低于間歇式，這可以有效避免在發(fā)酵初期高質量濃度糖對酵母的抑制作用。

從乙醇生成情況來看，發(fā)酵前7 h內(nèi)，大種量流加式發(fā)酵乙醇生成速率為5.91 g/（L·h），間歇式發(fā)酵過程中乙醇生成速率為3.04 g/（L·h）。在發(fā)酵7~50 h內(nèi)，大種量流加發(fā)酵一直保持穩(wěn)定的乙醇生成速率（2.00 g/（L·h））。 在間歇式發(fā)酵過程中，發(fā)酵的第7~20 h，20~40 h和40~50 h階段，乙醇生成速率分別 4.7、13.8、0.39 g/（L·h）。 在主發(fā)酵期，大種量流加式發(fā)酵的乙醇生成速率基本維持恒定。間歇式發(fā)酵過程中，乙醇生成速率先快后慢。發(fā)酵15 h后，間歇式發(fā)酵乙醇質量濃度高于流加式，而高乙醇質量濃度會破壞酵母細胞膜的穩(wěn)定性，降低發(fā)酵速率，延長或中止發(fā)酵。采用大種量流加式發(fā)酵工藝，可以有效避免前期高質量濃度糖和中后期高質量濃度乙醇對酵母的脅迫和毒害作用，使得酵母在整個發(fā)酵過程中有較高活力，從而提高乙醇產(chǎn)量。

2.4 不同初始糖和乙醇質量濃度對間歇式乙醇發(fā)酵的影響

為了進一步證明這一結論，本文作者研究了不同初始糖質量濃度和乙醇質量濃度對發(fā)酵的影響。由圖8可以看出，當初始葡萄糖質量濃度從180 g/L上升到290 g/L，酵母最大耗糖速率降低了41.2%（從 1.7 g/（L·h）到 1.0 g/（L·h））。 與此同時，乙醇最大生成速率降低了 40%（從 1.0 g/（L·h）到 0.6 g/（L·h））。此外，糖質量濃度過高會抑制酵母的生長和繁殖（圖8（b）），導致耗糖速率和乙醇生成速率降低（圖8（a））。因為高質量濃度葡萄糖導致發(fā)酵液滲透壓增大，抑制酵母生長和發(fā)酵的正常進行[19]。

由圖8（c）可以看出，初始乙醇質量濃度從0 g/L上升到38 g/L后，酵母最大耗糖速率降低了48%（從 2.5 g/（L·h）到 1.3 g/（L·h））。同時，乙醇最大生成速率降低了 19%（從 1.0 g/（L·h）到 0.81 g/（L·h））。進一步增加初始乙醇質量濃度時，發(fā)酵基本停止。高質量濃度乙醇會抑制酵母的生產(chǎn)和繁殖（圖8（d）），導致耗糖速率和乙醇生成速率降低（圖8（c））。這與張強等之前關于乙醇耐受性的研究是一致的[20]。

圖8 不同初始葡萄糖和乙醇質量濃度下，間歇式發(fā)酵過程中的葡萄糖消耗，乙醇生成速率和酵母數(shù)，出芽率的變化情況Fig.8 Change of glucose consumption，ethanol production rate and number，budding rate of yeast in batch fermentation process under different initial glucose and ethanol concentration

3 結語

間歇式稀醪乙醇發(fā)酵過程中，糖質量濃度和乙醇質量濃度都比較低，酵母生長繁殖和發(fā)酵不會受到抑制，發(fā)酵效果良好。高濃度乙醇發(fā)酵中，采用間歇式工藝雖然酒度可以提高，但會出現(xiàn)發(fā)酵殘還原糖和殘糊精質量濃度高，糖醇轉化率低的問題。其原因是發(fā)酵前期糖質量濃度和發(fā)酵后期乙醇質量濃度較高[21]。PANCHAL等[22]提出，當酵母處在高滲透壓環(huán)境下，會出現(xiàn)胞內(nèi)乙醇積累現(xiàn)象，這會對乙醇合成相關酶造成不利影響。本文實驗證明，隨著初始糖質量濃度和乙醇質量濃度的提高，酵母的合成速率和生長繁殖都受到抑制。PULIGUNDL等[20]報道，高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵過程中的高糖質量濃度和高乙醇質量濃度是影響發(fā)酵效果的主要因素，因此應選擇較低的糖質量濃度作為工藝優(yōu)化的目標。采用大種量流加式高濃度乙醇發(fā)酵工藝可以顯著降低清液殘總糖質量濃度。

研究接種量對工藝影響中發(fā)現(xiàn)：流加過程出現(xiàn)還原糖增高，且不隨著接種量的增大而消除。主要有以下幾個原因：1）前期種子數(shù)量較少，不能迅速消耗新補給的糖；2）流加速度過快，糖補給太迅速，同樣會導致糖無法被迅速消耗[23]；3）新料液在添加糖化酶后，前期糖化十分迅速，會產(chǎn)生大量還原糖，同時發(fā)酵液中也存在糖化過程，這兩者協(xié)同作用造成發(fā)酵液中還原糖質量濃度上升。初始流加時間過早，會因為種子液本身糖質量濃度較高，流加發(fā)酵降低糖質量濃度效果不明顯；過晚可能會出現(xiàn)碳源匱乏，不利于種子增殖及發(fā)酵?？疾炝骷訒r長對工藝影響時發(fā)現(xiàn)：流加時長過短會導致流加過程糖積累現(xiàn)象嚴重，發(fā)酵前期酵母仍處于高糖環(huán)境中；流加時長過長則會出現(xiàn)酵母耗糖速率大于補糖速率，酵母發(fā)酵中后期碳源匱乏，導致發(fā)酵中止。本文優(yōu)化后的大種量流加工藝為：30%接種量下，培養(yǎng)8 h后將剩余料液通過20 h勻速流加到發(fā)酵體系。發(fā)酵結束后酒度明顯提高的同時，發(fā)酵殘?zhí)敲黠@降低，殘?zhí)撬竭_到了稀醪發(fā)酵下的水平。岳雷[24]提出，在谷氨酸發(fā)酵中采用低初糖，流加高糖工藝可避免發(fā)酵初期高滲透壓對菌體的影響，菌體生長旺盛，有利于發(fā)酵產(chǎn)物的生成。大種量流加式高體積分數(shù)乙醇發(fā)酵工藝發(fā)酵前期的糖質量濃度和發(fā)酵中后期的乙醇質量濃度均較低，有效避免了高質量濃度糖及乙醇對酵母的脅迫和毒害作用，促進了酵母對糖的利用，提高了酵母發(fā)酵力。該工藝操作簡單，無需添加設備或改動管路，可基于目前大部分工廠現(xiàn)有的發(fā)酵設備進行發(fā)酵，有望在今后的乙醇發(fā)酵行業(yè)得到推廣。