基于模塊化優化策略強化大腸桿菌合成血紅素

翁煥嬌 ， 丁雯雯 ， 石雅南 ， 李江華 *， 康 振

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

血紅素是一種存在于生物體內的含鐵卟啉衍生物，由原卟啉與1個二價鐵原子構成[1]。其核心是亞鐵離子，具有攜氧能力，是有氧呼吸及厭氧呼吸電子傳遞鏈蛋白質的重要組分，參與生物細胞中的多種氧化代謝，包括氧氣運輸、氧化應激反應和依賴于電子傳遞的氧化磷酸化等；除此之外，它還參與其他雙原子氣體的合成，例如一氧化碳和一氧化氮[2-3]。作為一個調節因子，血紅素通過在轉錄水平、翻譯水平、蛋白質靶定、蛋白質穩定性和分化等方面介導基因的表達[4-12]。目前，血紅素不僅在食品行業常被用于著色劑，如腸類制品；在醫學臨床上也廣泛的使用，如作為半合成膽紅素原料，生產抗肝功能亢進、抗炎癥作用和抗腫瘤作用的重要藥物等。此外，血紅素也是良好的補血劑，亞鐵血紅素可直接被人體吸收，吸收率高達10%~20%[13-16]。

包括血紅素在內的卟啉類化合物的合成可以通過化學合成，但是由于它們結構復雜，合成過程中反應步驟繁瑣，得率比較低，使得卟啉類化合物價格昂貴[17]。為此，微生物成為生產結構復雜的卟啉類化合物的最佳選擇。隨著基因工程技術的成熟，選擇大腸桿菌作為宿主大量合成血紅素具有廣闊的前景[1，18]。

在生物體內，血紅素的合成需要經過多步酶促反應，且途徑中涉及到的酶大部分都是高度保守的[2]。 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是合成血紅素的關鍵前體物質[19]。如圖1（a）所示，兩分子ALA在依賴于Zn2+的ALA脫水酶（HemB，由基因hemB編碼）催化下縮合生成膽色素原，然后4分子膽色素原在羥甲基膽素合成酶（HemC，由基因hemC編碼）的作用下進一步縮合生成不穩定的羥甲基膽素，接著在尿卟啉原Ⅲ合成酶（HemD，由基因hemD編碼）的環化作用下生成含有四吡咯環的尿卟啉原Ⅲ，再經過尿卟啉原Ⅲ脫羧酶（HemE，由基因hemE編碼）的作用，將尿卟啉原Ⅲ的4個側鏈脫羧化形成甲基，生成糞卟啉原Ⅲ；糞卟啉原Ⅲ在糞卟啉原Ⅲ氧化酶（HemF，由基因hemF編碼）的催化作用生成原卟啉原Ⅸ，同時釋放H2O2和CO2。在原卟啉原氧化酶（HemG，由基因hemG編碼）催化下去除原卟啉原Ⅸ的6個氫原子生成原卟啉Ⅸ。最后亞鐵螯合酶（HemH，由基因hemH編碼）通過在原卟啉Ⅸ的內部螯合鐵離子形成血紅素，從而完成整個血紅素合成途徑。

圖1 大腸桿菌中血紅素合成途徑及途徑基因分模塊組合方式示意圖Fig.1 Heme biosynthesis pathway in E.coli and the modular assembling ways of genes

在大腸桿菌中，ALA的合成受血紅素的嚴格反饋調控[20]。張俊麗等發現，過量表達血紅素合成途徑基因hemD、hemF有利于ALA的積累[21]。Kwon等成功在大腸桿菌中表達來源于類球紅細菌的hemA基因，合成血紅素[22]。此外，通過異源表達泛酸途徑的coaA基因和卟啉合成途徑的hemB、hemC、hemD、hemE基因，也可獲得高產血紅素的菌株，但是這個產量對于工業生產來講，還是較低[23]。因此，進一步對血紅素合成途徑進行改造，提高血紅素產量是十分必要的。

微生物代謝網絡往往復雜且多變，通過引入模塊化組合策略能很好地解決代謝途徑中代謝流量的平衡問題，提高產量和轉化率[24]。由于血紅素合成途徑調控機理復雜，受多方面因素影響[25-26]。為了進一步促進血紅素的積累，本研究將ALA C5合成途徑關鍵酶基因hemL和hemA劃分為第一模塊，用高拷貝質粒pUC19過量表達，同時將來源于大腸桿菌血紅素生物合成途徑的基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH分為第二、第三模塊，其中基因hemB、hemC、hemD、hemE為第二模塊，基因hemF、hemG、hemH為第三模塊，利用拷貝數不同的質粒改變第二、第三模塊中基因的表達強度，對這2個模塊的基因組合表達，得到的重組菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7，在 250 mL 的搖瓶發酵48 h 時，其血紅素產量分別為 0.08、0.09、0.25、0.35、0.44、0.56、 0.46 μmol/（L·OD）。 將搖瓶水平上血紅素產量最高的重組菌株E.coli-D6在3 L發酵罐中進行放大培養，48 h 時產量達到 0.954 μmol/（L·OD）。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 菌株E.coliJM109，用于重組質粒的構建；E.coliDH5α，作為宿主細胞，用于重組質粒的表達。相關質粒和菌株見表1。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要試劑和工具酶 質粒小量提取試劑盒、細菌基因組提取試劑盒、抗生素包括氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素和鏈霉素等、IPTG等，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；膠回收試劑盒和各種限制性內切酶等，購自Thermo公司；Primer Star Max DNA聚合酶、DNA連接酶、感受態細胞制備試劑盒，購于寶生物工程（大連）有限公司；5-氨基乙酰丙酸和膽色素原，購于Sigma-Aldrich公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購于Oxoid公司；其他化學試劑，均購于上海國藥集團，純度為分析純。

1.1.3 培養基 LB培養基（g/L）：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉 5.0，pH 7.0；裝液量 8 mL/dL；

發酵培養基 （g/L）：（NH4）2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 15，MgSO4·7H2O 1.0， 酵母提取物1.0，葡萄糖 20；pH 7.0，裝液量 30 mL/250 mL。

分批發酵培養基 （g/L）：（NH4）2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 15，MgSO4·7H2O 1.0，酵母撮物1.0，葡萄糖 35；pH 7.0，裝液量 1.5 L/3 L。

固體培養基是在此基礎上添加2.0 g/L瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 血紅素合成途徑2個模塊的相關表達載體構建 以E.coliDH5α基因組為模板分別擴增hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH基因，然后以融合PCR將hemC和hemD片段融合為hemC-hemD，將hemG和hemH片段融合為hemG-hemH。引物表2所示。

表2 引物Table 2 Primers used in this study

利用酶切位點PstⅠ和HindⅢ將片段hemC-hemD分別與表達載體pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2連接，獲得重組載體pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD。通過BamHⅠ和SacⅠ將片段hemB分別與載體pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD連接，得到重組載體pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD。將擴增得到的hemE片段通過酶切位點NdeⅠ和XhoⅠ分別連接到pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD中，得到重組質粒pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE。

利用酶切位點BamHⅠ和HindⅢ將從大腸桿菌基因組擴增得到的片段hemF分別與表達載體pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2 連接，獲得重組載體pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF。通過NdeⅠ和XhoⅠ將片段hemG-hemH分別與載體pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF連接，得到重組載體pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH。

1.2.2 大腸桿菌合成血紅素相關重組工程菌株的構建 將本實驗室保藏的質粒pUC19-hemA-hemL轉化菌株E.coliDH5α，得到重組菌株E.coliDH5α：pUC19-hemA-hemL。將大腸桿菌血紅素合成途徑兩個模塊的相關重組質粒兩兩組合，轉化菌株E.coliDH5α：：pUC19-hemA-hemL， 得到重組工程菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7：

E.coli-D1：pUC19-hemA-hemL；

E.coli-D2：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D3：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D4：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D5：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D6：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D7：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH。

1.2.3 菌株培養條件

1）搖瓶培養。挑取在斜面培養基中培養的重組菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7， 接種于LB培養基，37℃過夜培養約12 h后，以體積分數1%接種量轉接發酵培養基中發酵，0 h時添加0.1 mmol/L IPTG誘導基因表達以及對應的抗生素，氨芐青霉素（100μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）、鏈霉素（50 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL），37 ℃，220 r/min 培養，4 h 時添加 100 μmol/L 的 FeSO4，周期 48 h。

2）分批培養。挑選已在平板上活化的重組菌株E.coli-D6，接種于LB培養基，37℃過夜培養約12 h后，以體積分數2%接種量轉接到裝有1.5 L發酵培養基的3 L發酵罐中培養，0 h時添加0.1 mmol/L IPTG誘導基因表達以及對應的抗生素，氨芐青 霉素 （100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL），37 ℃，400 r/min 培養，4 h 時添加100 μmol/L的FeSO4，通過流加 4 mol/L的 NaOH 將發酵液的pH控制在6.5左右，發酵周期48 h。

1.2.4 分析方法

1）OD600測定。取適量發酵液于 EP管中，12000 r/min離心3 min，棄上清液，用等體積去離子水重懸菌體；重懸液經適當稀釋后，以去離子水為空白對照，在紫外分光光度計600 nm波長下，測定細胞濃度。

2）葡萄糖質量濃度測定。取適量發酵液于EP管中，12000 r/min離心3 min，以適當的倍數稀釋發酵液上清液，用SBA-40C生物傳感分析儀（山東省科學院）檢測葡萄糖質量濃度。

3）ALA質量濃度測定。ALA質量濃度測定采用Mauzerall和Granick的分光光度法[27]：取適量發酵液于EP管中，12000 r/min離心3 min，以適當的倍數稀釋發酵液上清液。取稀釋液300 μL，分別加入400 μL的乙酸鈉緩沖液（稱取82 g無水乙酸鈉，加入57 mL冰醋酸，并用去離子水定容至1 L）和35 μL的乙酰丙酮，混合均勻后煮沸反應10 min。冷卻至室溫，再加入 Modified Ehrlich’s reagent試劑（稱取1 g對二甲氨基苯甲醛，加入體積分數70%高氯酸8 mL，并用冰醋酸定容至50 mL）反應10 min，在紫外分光光度計556 nm波長下，測定吸光值，然后根據不同濃度的ALA標準樣品在556 nm波長下的吸光值計算出樣品ALA的質量濃度。

4）膽色素原質量濃度測定[27]。取等OD發酵液于EP管中，4℃，12000 r/min離心5 min，棄上清液；用0.25 mol/L的磷酸氫二鈉緩沖液（稱取6.703 g磷酸氫二鈉，溶于100 mL去離子水中，并用0.25 mol/L的檸檬酸溶液調節pH至6.65）清洗2次菌體后重懸菌體，并使用超聲破碎儀破碎細胞；將細胞裂解液在4℃、12000 r/min條件下離心5 min，取裂解液上清液500 μL，加入等體積的The regular Ehrlich’s reagent試劑 （稱取2 g對二甲氨基苯甲醛，溶于100 mL濃鹽酸），室溫反應5 min后在紫外分光光度計554 nm波長下測定吸光值，然后根據不同濃度的膽色素原標準樣品在554 nm波長下的吸光值計算出樣品中膽色素原的質量濃度。

5）血紅素質量濃度測定。血紅素質量濃度的測定采用熒光法[28]：取適量發酵液于EP管中，12000 r/min離心3 min，棄上清液，用等體積去離子水重懸菌體，測定其OD600；準備2個相同的1.5 mL EP管（其中一個作為對照實驗），分別加入0.1 OD的細胞重懸液，同時加入200 mmol/L草酸溶液，將其總體積補足至500 μL，然后加入2 mol/L草酸溶液500 μL，混合均勻后迅速在100℃條件下反應30 min，對照組放置在室溫條件下。待樣品自然冷卻后在12000 r/min條件下離心5 min，取200 μL上清液于黑色96孔板中，在酶標儀中測定樣品和對照組的熒光值，其中血紅素熒光測定的激發波長為400 nm，發射波長為620 nm。根據不同濃度血紅蛋白標準樣品的熒光值計算出樣品中血紅素的質量濃度。

2 結果與討論

2.1 血紅素合成途徑分析與模塊化構建

在微生物代謝和工業生物技術中，如何找到一種高效的方法解決微生物代謝途徑中代謝流的平衡已成為一個難題。傳統的理性設計策略往往不能對細胞代謝有一個整體把握；而組合方法雖然覆蓋面較廣，但是需要進行高通量篩選。對此，Bradley等[24]提出一個多模塊代謝工程改造理論（multivariate modular metabolic engineering，MMME），將代謝途徑中的關鍵酶分為特定的模塊，同時通過控制不同模塊的表達水平來平衡代謝途徑中的代謝流。由于MMME方法簡單，應用廣泛，已逐漸成為代謝工程和工業生物技術領域中重要的改造手段。

根據Gunhild等[29]對血紅素合成途徑中酶分子結構和功能的分析，血紅素合成途徑中的中間產物不穩定，所有的卟啉原類物質會快速氧化成相關的卟啉類物質，因此可以推測血紅素合成途徑中的酶分子之間可能存在相關作用。例如，為了避免尿卟啉原Ⅰ的積累，HemC和HemD可能會形成一個蛋白復合體，而且在細菌中，編碼HemC和HemD的基因是由同一個操縱子操控的；在HemH作用下將鐵離子螯合進原卟啉Ⅸ內部的這個過程中需要HemG的參與[30]，因此推測HemG和HemH之間會形成一個蛋白復合體，根據文獻報道，已經在藍細菌中驗證HemG與HemH的蛋白復合體的存在[31]。在本研究中為了保證血紅素合成的前體物質ALA的質量濃度，將ALA合成的關鍵基因hemAs和hemL劃分為第一模塊，用pUC19質粒過量表達；為了優化大腸桿菌中血紅素合成途徑的相關基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH，將 這7 個基因分為 2 個模塊，hemB、hemC、hemD、hemE基因為第二模塊，hemF、hemG、hemH為第三模塊，并使用3個兼容質粒pRSFDuet-2（高拷貝質粒）、pCDFDuet-2（中低拷貝質粒）和 pACYCDuet-2（低拷貝質粒），對第二、第三模塊中的基因進行組裝優化表達（圖1），考察其對血紅素產量的影響。

以E.coliDH5α基因組為模板分別擴增hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH基因，同時將片段hemC、hemD融合為hemC-hemD，片段hemG、hemH融合成hemG-hemH，得到基因片段凝膠電泳圖如圖2所示。將上述各基因片段連接到TVector pMD19（Simple）上，測序正確后，將質粒雙酶切，得到的各重組基因片段與經過相同酶切位點處理后的表達載體連接，構建一系列重組載體。

2.2 血紅素合成途徑優化與血紅素的強化

將構建好的重組載體兩兩組合，轉入含有pUC19-hemAs-hemL質粒的大腸桿菌DH5α中，得到重組菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7，進行搖瓶發酵培養，在培養4 h后添加100 μmol/L Fe2+，測定菌體生長情況、ALA積累量、膽色素原質量濃度和血紅素產量。如圖3所示，血紅素產量越高，重組菌的發酵液顏色越紅；其中，重組菌E.coli-D2用高拷貝質粒表達第二模塊的基因，用中低拷貝質粒表達第三模塊的基因時，其生物量遠低于其他菌株，可能是由于基因hemG的產物原卟啉Ⅸ的過量積累對細胞具有毒害作用[32]；而且過量表達ALA下游途徑的基因后，ALA產量與重組菌E.coli-D1（沒有過量表達ALA下游途徑基因）相比，明顯下降；同時檢測了表達基因hemB后的產物PBG，發現各重組菌株的PBG產量沒有明顯差異，推測可能是HemB蛋白比較穩定，并不是血紅素合成途徑中的限速酶；另外，從圖3（e）中可以看出，用中低拷貝質粒表達第二模塊的基因，血紅素產量較高，其中6號菌株用低拷貝質粒表達第二模塊的基因，用高拷貝表達第三模塊的基因，其血紅素產量最高，達到0.56 μmol/（L·OD）。

圖3 血紅素合成途徑基因分模塊表達對細胞生長代謝的影響Fig.3 Effect of expression of genes in heme biosynthesis pathway on cell metabolism

2.3 血紅素分批發酵

選擇搖瓶發酵培養中血紅素產量最高的重組菌株E.coli-D6，進一步驗證其合成血紅素的能力，將E.coli-D6在3 L發酵罐中進行放大培養，同樣在培養4 h后添加100 μmol/L Fe2+，發酵過程參數變化如圖4所示。

圖4 重組菌株E.coli-D6在3 L發酵罐中分批培養合成血紅素Fig.4 Batch fermentation of heme by the recombinant strain E.coli-6 in a 3 L fermentor

從圖4可以看出，12 h后葡萄糖開始大量被消耗，重組菌株開始大量積累ALA，40 h左右ALA產量最高，達到3865 mg/L，隨著血紅素在菌體生長后期的積累，ALA開始消耗，產量慢慢下降，在48 h發酵結束時，ALA產量剩余2789 mg/L；28 h后，重組菌株開始大量合成血紅素，在發酵48 h時，此時葡萄糖幾乎完全耗盡，血紅素產量最高，達到0.954 μmol/（L·OD），與搖瓶水平上血紅素的產量相比，提高了約70%。在整個發酵過程中，ALA大量積累，雖然后期隨著血紅素的積累，ALA開始消耗，但是明顯從ALA到血紅素的轉化率仍然很低。血紅素的合成途徑中存在其他競爭的分支途徑，研究表明，HMB自發環化形成糞卟啉原Ⅰ以及原卟啉到血紅素的轉化率低是血紅素合成過程中的限速步驟[1]。如何進一步提高ALA到血紅素的轉化率可作為下一步研究的重點。

3 結 語

血紅素合成途徑復雜且受嚴格調控，目前關于血紅素合成方面的研究比較少。本研究通過將來源大腸桿菌的血紅素合成途徑基因分成2個模塊，利用拷貝數不同的質粒，將2個模塊隨機組合，在過量表達谷氨酰-tRNA還原酶（hemA編碼）、谷氨醛氨基轉移酶（hemL編碼）的基礎上，強化了血紅素合成途徑。本研究構建的重組大腸桿菌工程菌E.coli-D6：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH搖瓶發酵培養48 h，生產血紅素0.56 μmol/（L·OD）。 在 3 L 發酵罐中進行分批培養，其血紅素濃度達到 0.954 μmol/（L·OD）， 比搖瓶上提高了70%。采用代謝工程策略，改造微生物菌株來合成目的產物血紅素，有效提高了血紅素產量。