蕎麥蜂花粉多糖A的分離及其降血糖活性

錢明輝， 達(dá)熱卓瑪， 徐德平

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

蜂花粉作為一種高價(jià)值的天然食品，不僅營養(yǎng)豐富，還存在大量生物活性物質(zhì)[1]，被稱為“微型營養(yǎng)庫”。而蜂花粉多糖作為花粉中的一種活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力[2-4]、抗病毒[5-6]、調(diào)節(jié)血脂[7]及抗腫瘤[8]、抗氧化[9]等多種活性。目前有關(guān)蕎麥蜂花粉多糖的研究集中在提取工藝[10-11]與生物活性[12]上，而對蕎麥蜂花粉多糖結(jié)構(gòu)方面的研究尚少見報(bào)道。本文利用多種色譜技術(shù)對蕎麥蜂花粉多糖進(jìn)行分離，并對其化學(xué)結(jié)構(gòu)、降血糖活性進(jìn)行了研究，以期為蕎麥花粉資源的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥蜂花粉，購于內(nèi)蒙庫倫旗蜂場；昆明小鼠（60只，雄性，4周齡），購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；鏈脲佐菌素（STZ），購于Sigma公司；鹽酸二甲雙胍，購于上海華氏制藥有限公司；DEAE-52（40~50 μm）離子交換柱，購于上海生化試劑公司；HW-55F（30~60 μm）凝膠柱，購于日本 TOSOH 公司；Sephacryl S-400 （25~75 μm）、Sephadex G-100（10~40 μm）凝膠柱，購于瑞典 Pharmaeia 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

不銹鋼五谷雜糧磨粉機(jī)：浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠產(chǎn)品；RAT-100D雙層玻璃反應(yīng)釜：無錫申科儀器有限公司產(chǎn)品；RE-5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海一科儀器有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo公司產(chǎn)品；羅氏卓越血糖儀：德國Roche Diagnostics GmbH公司產(chǎn)品；核磁共振儀 Avance 500 MHz：Bruker公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蕎麥蜂花粉粗多糖的制備 將10 kg蕎麥蜂花粉粉碎后，過40目篩，投入100 L萃取罐，按料液質(zhì)量體積比 1 g∶8 mL加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，并在60℃條件下提取3 h，過濾取濾渣，抽濾后的濾渣按1 g∶6 mL的料液比加入去離子水，并在60℃下提取3 h，過濾得上清液，真空濃縮至 1 L，按 1∶4的體積比加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇并攪拌，靜置一夜后，抽濾得沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗滌3次，然后真空干燥、Sevag法脫蛋白、大孔樹脂AB-8脫色，冷凍干燥得粗多糖。

1.3.2 DEAE-52離子交換柱分離 取粗多糖溶于蒸餾水，配成200 mg/mL的溶液，上樣量為50 mL，進(jìn)行 DEAE-52離子交換柱（6 cm×60 cm）分離，分別用蒸餾水以及0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為6 mL/min，利用自動(dòng)收集器收集洗脫液，10 mL/管，用苯酚-硫酸法檢測，合并收集各含糖的峰。

1.3.3 凝膠柱分離 取離子柱下來的樣品，依次上HW-55F （3 cm×100 cm）、Sephacryl S-400 （3 cm×100 cm）凝膠色譜柱進(jìn)行分離，上樣量為20 mL，質(zhì)量濃度為40 mg/mL，洗脫液為蒸餾水，洗脫速度為2 mL/min，用自動(dòng)分部收集器10 mL/管收集，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測，合并收集各含糖的峰。

1.3.4 純度鑒定 蒸餾水配成樣品質(zhì)量濃度5 mg/mL的多糖A溶液，在200～400 nm下進(jìn)行紫外全掃描。多糖A上Sephadex G-100色譜柱鑒定其純度，流速為2 mL/min，蒸餾水洗脫，苯酚-硫酸法檢測。

1.3.5 多糖A的降血糖活性測定 小鼠禁食不禁水16 h，腹腔注射檸檬酸緩沖液配置的STZ溶液，劑量為120 mg/kg，注射體積與小鼠體質(zhì)量比為10 mL/kg。7 d后將小鼠禁食12 h，剪尾采血，用羅氏血糖儀測小鼠空腹血糖，血糖值在11.1～24.0 mmol/L范圍內(nèi)的小鼠為造模成功小鼠。將造模成功小鼠分為高血糖模型組、陽性對照組、多糖A低劑量組、多糖A高劑量組4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置正常對照組，每組各10只。正常對照組與高血糖模型組灌胃等體積的生理鹽水，而多糖A低、高劑量組分別按 100、300 mg/（kg·d）的劑量灌胃多糖 A，陽性對照組按300 mg/（kg·d）的劑量灌胃鹽酸二甲雙胍，每天給藥1次連續(xù)給藥30 d，末次給藥后禁食12 h，剪尾采血測定血糖。然后各組小鼠用葡萄糖溶液經(jīng)口灌胃，劑量為2.0 g/kg，分別于給糖后0、15、30、60、120 min 測血糖值。

1.3.6 結(jié)構(gòu)分析 多糖A以四甲基硅烷 （TMS）為內(nèi)標(biāo)物，以氘代吡啶為溶劑，利用核磁共振儀Avance 500 MHz對其進(jìn)行135DEPT-NMR、13C-NMR和1H-NMR分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子柱分離結(jié)果

粗多糖用DEAE-52離子交換柱分離，經(jīng)蒸餾水和不同濃度梯度的NaCl溶液洗脫后，得到圖1所示的蕎麥蜂花粉粗多糖洗脫曲線。從圖1可以看出主要有4個(gè)洗脫峰，分別為 QQC1、QQC2、QQC3、QQC4，由洗脫液的吸光值可知，多糖組分主要集中在蒸餾水洗脫的QQC1與QQC2，而NaCl洗脫的QQC3與QQC4含量較少，因此將組分QQC2作為進(jìn)一步研究對象。

圖1 DEAE-52離子交換柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of DEAE-52 ion-exchange column

2.2 凝膠柱分離結(jié)果

多糖QQC2經(jīng)HW-55F凝膠柱分離得到QQC2a、QQC2b、QQC2c 等 3 個(gè)組分，所得洗脫曲線如圖2所示，其中QQC2a組分占中性多糖的質(zhì)量密度最大，因此選其作為進(jìn)一步分離對象。QQC2a經(jīng)Sephacryl S-400凝膠柱反復(fù)分離，最終得到多糖A，由圖3洗脫曲線可以看出，多糖A洗脫峰呈單一對稱峰。

圖2 HW-55F凝膠柱洗脫曲線Fig.2 Elution curve of HW-55F gel column

圖3 Sephacryl S-400凝膠柱洗脫曲線Fig.3 Elution curve of Sephacryl S-400 gel column

2.3 純度鑒定結(jié)果

從圖4可知，多糖A溶液在260 nm與280 nm波長處不存在吸收峰，這說明多糖A不含核酸與蛋白質(zhì)或者是含量極低。從圖5可以看出，多糖A經(jīng)Sephadex G-100色譜柱洗脫，洗脫峰呈單一對稱峰，說明多糖A為均一多糖。

圖4 多糖A紫外掃描圖Fig.4 UV scan of polysaccharide A

圖5 Sephadex G-100色譜柱洗脫曲線Fig.5 Elution curve of Sephadex G-100 column

2.4 多糖A的降血糖活性測定結(jié)果

從表1可以看出，與正常對照組相比，給藥前的高血糖模型組、陽性對照組以及多糖A高、低劑量組的血糖值明顯升高，差異顯著（P＜0.01），說明造模成功。給藥30 d后，高血糖模型組、陽性對照組以及多糖A高、低劑量組小鼠的血糖值分別是21.23、15.43、17.35、18.05，與高血糖模型組血糖值相比，陽性對照組以及多糖A高、低劑量組小鼠的血糖值都顯著降低（P＜0.01），降低率分別為 27.44%、18.46%、15.11%，說明多糖A具有降低糖尿病小鼠血糖值的作用，但是與鹽酸二甲雙胍的降糖作用相比要弱。與多糖A低劑量組相比，多糖A高劑量組血糖值有下降趨勢，但是高、低劑量組的血糖值無顯著性差異，并沒有體現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。

表1 多糖A對糖尿病小鼠血糖的影響（n=10，x±s）Table 1 Effect of polysaccharide A on blood glucose in diabetic mice（n=10，x±s）

從圖6可知，正常對照組小鼠血糖在15 min達(dá)到最大值，隨后逐漸下降，120 min時(shí)恢復(fù)到正常水平。模型組在30 min達(dá)到最大值，隨后逐漸降低，120 min時(shí)還維持在較高水平。與正常組相比，模型組小鼠的血糖值下降緩慢，一直維持在高值，說明模型組小鼠對血糖敏感性弱，調(diào)節(jié)血糖能力差。多糖A低劑量組與高劑量組的血糖在15 min時(shí)達(dá)到最大值并且在30 min時(shí)有下降趨勢，隨后逐漸降低，120 min時(shí)恢復(fù)到了初始值附近，與模型組相比，多糖A低劑量組與高劑量組的血糖值下降得更快，同時(shí)能快速降低到初始值，表明多糖A低劑量組與高劑量組都有提高糖尿病小鼠糖耐量的能力。

多糖A低劑量組能顯著降低糖尿病小鼠的血糖值同時(shí)提高其糖耐量，這表明了低劑量的多糖A就能起到很好的降血糖效果。多糖A低劑量組與多糖A高劑量組的血糖值相比，無顯著性差異，說明多糖A的降糖效果與劑量沒有顯著量效關(guān)系，單一增加劑量不能顯著提升多糖A對糖尿病小鼠的治療效果。這可能與多糖A的降血糖機(jī)制有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。多糖A發(fā)揮降糖作用的原因可能是多糖A具有抗氧化作用，提高了還原型谷胱甘肽及超氧化物歧化酶的活性，從而修復(fù)受損傷的胰島細(xì)胞或者使胰島細(xì)胞再生，也可能是通過提高糖尿病小鼠胰島的敏感性、促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃蛘呤翘岣吒纹咸烟羌っ富钚缘淖饔肹13-15]來實(shí)現(xiàn)降血糖。蕎麥蜂花粉多糖的降糖作用雖然比鹽酸二甲雙胍弱，但是毒性較小或無毒副作用，可以把蕎麥多糖A開發(fā)成糖尿病患者的保健食品或者輔助治療藥品。

2.5 多糖A結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

多糖A的1H-NMR、13C-NMR、135DEPT-NMR譜見圖7-8。從1H-NMR可見，在異頭質(zhì)子區(qū)（δ4.5~δ5.9）存在5個(gè)信號較強(qiáng)的H信號，分別是δ5.303、δ5.256、δ5.233、δ5.205、δ5.014， 這 5 個(gè) H 應(yīng)為糖上端基H。從13C-NMR可見，在δ90~δ115范圍內(nèi)存在5 個(gè) C 信 號 ，分 別 是 δ110.19、δ109.62、δ109.12、δ106.10、δ105.34，這 5 個(gè) C 應(yīng)為糖上端基 C，可以推測多糖A含有5個(gè)化學(xué)環(huán)境不同的糖殘基。根據(jù)豐度可以推測 δ106.1、76.5、75.3、73.5、71.4、72.2 應(yīng)為主鏈，從化學(xué)位移值來看應(yīng)為葡萄糖。從135DEPTNMR譜看出δ72.2為CH2，應(yīng)為C6的信號，正常情況C6值為60左右，表明主鏈C6成苷鍵，因此推測主鏈為1→6連接。在碳譜中一般α構(gòu)型異頭碳化學(xué)位移值小于103，β構(gòu)型的異頭碳化學(xué)位移值大于103，多糖A主鏈C1的化學(xué)位移值為106.1，因此推測主鏈?zhǔn)铅聵?gòu)型。

在碳譜中有δ176.36、173.36二個(gè)羧基信號，多糖A是蒸餾水洗脫下來的中性糖，所以排除存在糖醛酸的可能，紫外光譜顯示在260 nm與280 nm波長處不存在吸收峰，這說明多糖A是不含蛋白質(zhì)的，因此推測δ176.36、δ173.36應(yīng)為2個(gè)氨基酸信號，并形成?；I，氨基酸種類及連接位置有待進(jìn)一步確定。

圖7 多糖A1H-NMR圖譜Fig.7 1H-NMR spectrum of polysaccharide A

圖8 多糖A13C-NMR和135DEPT-NMR圖譜Fig.8 13C-NMR and135DEPT-NMR spectrum of polysaccharide A

3 結(jié)語

蕎麥蜂花粉粗多糖經(jīng)DEAE-52離子交換柱、HW-55F、Sephacryl S-400凝膠柱依次分離，得到多糖A。多糖A具有降低糖尿病小鼠血糖值、提高糖尿病小鼠糖耐量的作用。通過多糖A的13C-NMR、135DEPT-NMR譜等分析可以推測多糖A大致的框架是主鏈由（1→6）-β-葡萄糖組成的，在側(cè)鏈上連有氨基酸，蕎麥蜂花粉粗多糖連有氨基酸在文獻(xiàn)中屬于首次報(bào)道，有關(guān)多糖A的精細(xì)結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。