工業(yè)大麻雌株花葉多糖抑菌活性及穩(wěn)定性分析

郭孟璧， 郭 蓉， 郭鴻彥， 張慶瀅， 陳 璇， 許艷萍， 楊若菡， 楊明

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟作物研究所，云南 昆明 650205）

工業(yè)大麻是經(jīng)過遺傳改良的大麻品種，其毒性成分四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）＜0.3%，經(jīng)許可可以合法種植加工利用[1]。它是一種食用、藥用、纖維用為一體的高經(jīng)濟價值的作物，其莖稈纖維可用于紡織、建材和造紙，籽實可用于食品和藥品[2]，在云南、內(nèi)蒙古、黑龍江等多個省份均有廣泛的種植分布[3]。在工業(yè)大麻纖維收獲時，工業(yè)大麻雌株的花穗和葉片約占整個植株質(zhì)量的24%～25%[4]，若棄之不用則造成花葉資源的巨大浪費。因此，工業(yè)大麻雌株花葉的利用成為工業(yè)大麻多用途開發(fā)亟待解決的主要問題之一。

現(xiàn)有研究表明，大麻纖維對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌和對造成人體腳氣病的須癬毛癬菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌3種真菌具有顯著的抑制效果，其抗菌性可能與微量的脂溶性大麻酚類成分有關(guān)[5-7]。大麻莖皮脫膠產(chǎn)生的果膠中提取的皂苷類成分具有顯著的抗真菌作用[8]。大麻花葉中含有多糖、大麻酚類、萜類及黃酮等多種活性物質(zhì)，其中大麻酚類化合物對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有明顯的抗菌性能，齊墩果烯、齊墩果酸對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和白色念珠菌的抑制作用明顯[9-18]。植物多糖因其抑菌、抗腫瘤、增強免疫等方面的生理活性越來越受到廣泛的重視，然而目前尚未見國內(nèi)外對工業(yè)大麻花葉多糖抑菌活性進行研究的相關(guān)文獻報道。

本文作者以云南省種植面積最大的工業(yè)大麻品種“云麻1號”（THC質(zhì)量分數(shù)為0.15%）雌株花葉為材料，采用水提醇沉法得到工業(yè)大麻雌株花葉粗多糖（PFLFIH），研究其對9種常見人體致病菌的體外抑菌活性和穩(wěn)定性，為開發(fā)成本低廉、天然無毒的新型工業(yè)大麻花葉抑菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物樣品 工業(yè)大麻雌株花葉：采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所試驗地，為纖維型種植模式下“云麻1號”雌株始果期的頂部花穗，室內(nèi)陰干，粉碎后過40目篩，置于-4℃下保存。

1.1.2 供試菌種 肺炎鏈球菌 （ATCC31001-19），購自北京生物制品檢定所；蠟樣芽孢桿菌（FSCC115002）、新生隱球菌（GIM2.209），購自廣東省微生物菌種保藏中心；其余菌種均由昆明醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)試驗室提供。所選菌種見表1。

表1 供試菌種Table 1 Testing microorganisms

1.1.3 培養(yǎng)基 蠟樣芽孢桿菌采用廠家自帶液體培養(yǎng)基，大腸桿菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，白色念珠菌、新生隱球菌用沙保弱培養(yǎng)基，肺炎鏈球菌用血清肉湯培養(yǎng)基[19]。

1.1.4 儀器設(shè)備 VS-840K-U超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；H6303i生物顯微鏡，重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品；Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-50S11，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，廣東韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PFLFIH的制備 取1.1.1中粉碎過的干燥花葉粉末放入索氏提取器中，依次用石油醚（60～90℃）和體積分數(shù)70%乙醇回流，除去色素、酚類等雜質(zhì)，避光自然干燥。取上述處理過的花葉500 g，加蒸餾水3.5 L，沸水浴提取2 h，期間適當(dāng)補充蒸餾水。提取液過濾后，濾渣再重復(fù)提取2次。濾液合并后加熱濃縮至生藥與浸膏質(zhì)量比為1∶5，加入體積分數(shù)95%乙醇，至溶液中乙醇的體積分數(shù)為80%，均勻攪拌，4℃靜置24 h，過濾，依次用體積分數(shù)80%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，干燥后即得PFLFIH。

1.2.2 總糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的測定 PFLFIH的總糖質(zhì)量分數(shù)測定以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[20]。蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的測定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍染色法[21]。

1.2.3 THC含量的測定 稱取干燥樣品0.2000 g，用正己烷∶乙酸乙酯（體積比9∶1）溶液10 mL超聲提取5 min，靜置30 min后，用0.425 μm濾膜過濾后待測。采用液相色譜法[22]測定樣品的THC質(zhì)量分數(shù)。1.2.4 抑菌活性的測定 將供試菌種配置成菌液濃度為1×107CFU/mL的菌懸液，接種于相應(yīng)固體平板培養(yǎng)基上。將多糖配制成300 mg/mL的樣品液，-4℃保存?zhèn)溆谩２捎肒-B紙片法[23]，吸取20 μL樣品液于直徑為6 mm經(jīng)滅菌的濾紙片上，以無菌水作空白對照，陰干后貼于各培養(yǎng)基表面，放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，設(shè)置3個重復(fù)。平均抑菌圈＞7 mm，則有抑菌活性。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）的測定 將多糖用對倍稀 釋 法 分 別 配 制 成 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781、0.39、0.195 mg/mL（編號 1—10），設(shè)置不加藥液的為陽性對照，各試管的菌液接種量均為5×105CFU/mL，同時設(shè)置不加藥液、不接種菌的為陰性對照，37℃培養(yǎng)24 h，設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.6 最低殺菌濃度（MBC）的測定 將1.2.5中的含藥菌液接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基平皿中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用活菌計數(shù)法記錄試驗平皿上的菌落，平均小于5個菌落的最小稀釋度的藥物濃度即記錄為最低殺菌濃度（MBC），設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.7 抑菌穩(wěn)定性測定 將多糖分別進行紫外線照射、溫度、氧化劑與還原劑、不同酸堿處理后，采用1.2.4操作，記錄抑菌圈直徑，設(shè)置3個重復(fù)。采用Spss軟件中LSD方法進行差異顯著性分析 （P＜0.05）。

紫外線處理：用波長為253.7 nm的紫外線照射樣品，照射強度為30 W/cm2，照射距離為60 cm，照射時長設(shè)為 30、60、120 min；

溫度處理：將樣品于50、80、121℃下分別烘干處理2 h；

不同pH值溶液處理：用相同濃度（6 mol/L）的HCl和 NaOH 配制 pH 值為 4、5、6、7、8、9、10 的水溶液，將樣品分別溶解于不同pH值溶液中，室溫下放置24 h；

氧化劑與還原劑處理：分別用質(zhì)量分數(shù)為0.50、1.00、5.00 的 H2O2或 Na2SO3溶液處理樣品，室溫下放置24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFLFIH的產(chǎn)率及化學(xué)組成

用水提醇沉法提取PFLFIH，得率為7.25%。采用苯酚-硫酸法測得該粗多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)為81.0%，采用考馬斯亮藍染色法測定得其蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為7.41%。

2.2 工業(yè)大麻雌株花葉及PFLFIH中的THC質(zhì)量分數(shù)

按1.2.3方法檢測，“云麻1號”干燥雌株花葉中的THC質(zhì)量分數(shù)為0.15%，而從PFLFIH中未檢測到THC。利用THC不易溶于水的性質(zhì)，采用熱水提取乙醇沉降的工藝有效避免了THC在多糖中的富集，得到的多糖無毒品濫用隱患。

2.3 PFLFIH對不同供試菌種的抑菌活性

PFLFIH對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌效果，對其他供試的人體致病菌無抑制作用（見表2）。

表2 PFLFIH對不同供試菌種的抑菌活性Table 2 Antimicrobial abilities of PFLFIH

2.4PFLFIH對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

PFLFIH對金黃色葡萄球菌的MIC為3.125 mg/mL（見表 3），MBC 值為 6.25 mg/mL（如圖 1），殺菌效果顯著。

表3 工業(yè)大麻花葉多糖對金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果Table 3 MIC of PFLFIH against S.aureas

圖1 工業(yè)大麻多糖對金黃色葡萄球菌的MBC測定結(jié)果Fig.1 MBC results on S.aureus of PFLFIH

2.5 不同處理對PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的影響

2.5.1 紫外線照射對PFLFIH抑菌活性的影響 不同時長的紫外線照射后，PFLFIH的抑菌圈直徑在15.3~15.7 mm之間波動，與對照（16.3 mm）無顯著性差異（圖2），抑菌活性基本保持不變，對紫外線照射耐受性能較好。

圖2 不同時長紫外線照射后PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的變化Fig.2 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by UV irritation for different time

2.5.2 溫度對多糖抑菌活性的影響 經(jīng)溫度50~121℃的熱處理后，抑菌圈直徑在14.7~15.3之間波動，與對照相比無顯著差異，抑菌活性表現(xiàn)穩(wěn)定，具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度處理后PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的變化Fig.3 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by different temperatures

2.5.3 pH值對多糖抑菌活性的影響 PFLFIH在中性（pH為7）水溶液中的抑菌活性最強，在酸性與堿性水溶液中其抑菌活性均顯著降低（圖4）。pH值分別為 4、6、8、10時，與中性水溶液比較，多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別縮小9.8%、9.8%、9.8%和14.1%。

圖4 pH值對PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的影響Fig.4 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by pH values of solutions

2.5.4 氧化劑和還原劑對多糖抑菌活性的影響PFLFIH在質(zhì)量分數(shù)為0.5%～5.0%的氧化劑或還原劑溶液處理下，抑菌圈直徑分別在15.3~15.7和15.3~16.3之間波動（圖5），和對照相比抑制金黃色葡萄球菌的活性基本保持不變，抗氧化還原能力較強。

圖5 氧化劑和還原劑對PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的影響Fig.5 Effects of oxidant and reducer on the antimicrobial activities of PFLFIH

3 結(jié) 語

本研究中采用水提醇沉法得到的PFLFIH總糖質(zhì)量分數(shù)為81.0%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為7.41%，不含有THC。該多糖對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌活性，并且具有殺菌效果，最低抑制濃度 （MIC）為3.125 mg/mL，最低殺菌濃度（MBC）為 6.25 mg/mL。

PFLFIH具有較好的耐紫外線、耐高溫和耐氧化劑與還原劑的能力，在中性溶液環(huán)境下抑菌活性最強。酸性或堿性溶液的處理可能導(dǎo)致多糖發(fā)生變化，從而降低了對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。該多糖的組成及抑菌機理目前尚不明確，尚需進一步研究和探討。植物源抑菌劑因具有安全、來源廣泛、專一性強等優(yōu)點日益受到關(guān)注，成為開發(fā)應(yīng)用的熱點。工業(yè)大麻雌株花葉多糖能夠有效抑制并殺滅金黃色葡萄球菌，穩(wěn)定性較好，提取工藝流程簡單、成本低廉且無毒品安全隱患，具有巨大的開發(fā)潛力。