慢性乙型肝炎患者血清25-羥維生素D3與外周血T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性研究

羅 洽 孫 娟 陳永梅

三明市第二醫(yī)院消化內(nèi)科，福建省永安市 366000

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)在我國(guó)發(fā)病率較高，其由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染，傳染性強(qiáng)、嚴(yán)重危害人類身心健康(病情遷延不愈可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌)。流行病學(xué)調(diào)查顯示：在我國(guó)60%肝硬化、80%肝癌的病因?yàn)镠BV感染[1]，嚴(yán)重危害居民健康與生活質(zhì)量[2]。目前對(duì)于CHB病情進(jìn)展的原因仍不明確，有報(bào)道稱細(xì)胞免疫功能紊亂與免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)是CHB進(jìn)展與預(yù)后的重要因素[3]，而T淋巴細(xì)胞亞群為機(jī)體免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。維生素D是一類脂溶性維生素，鈣磷調(diào)節(jié)為其經(jīng)典的生理作用，而近些年發(fā)現(xiàn)其具有抗細(xì)胞增殖、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥等多種作用，缺乏可增加多種疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4]。張利娟等[5]研究發(fā)現(xiàn)：CHB血清內(nèi)25-羥維生素D3[25(OH)D3]水平較正常人明顯下降，且下降程度與肝臟纖維化進(jìn)展相關(guān)。因此，本課題組通過(guò)檢測(cè)CHB患者血清25(OH)D3及外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布情況，旨在探討25(OH)D3與T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—2018年6月入住我院消化內(nèi)科經(jīng)相關(guān)檢查診斷為慢性乙型病毒性肝炎(CHB)的患者100例為觀察組，其中男49例，女51例，年齡22～64歲，平均年齡(48.91±11.27)歲，平均BMI為25.20±4.11；同時(shí)選取同期我院門診健康體檢者100例作為對(duì)照組，其中男54例，女46例，年齡27～68歲，平均年齡(48.39±12.54)歲，平均BMI為25.33±4.18。兩組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在年齡、性別、BMI等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：CHB診斷參照慢性乙型肝炎防治指南(2015版)：即乙肝表面抗原(HBsAg)和(或)乙肝病毒DNA(HBV-DNA)陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)持續(xù)或反復(fù)升高，或存在肝組織學(xué)病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他病毒性肝炎(甲肝、丙肝、戊肝、丁肝)、自身免疫性肝病、酒精性肝炎、藥物性肝炎、非酒精性脂肪肝等；(2)已出現(xiàn)肝臟纖維化或肝硬化、肝臟腫瘤等；(3)合并嚴(yán)重心、腎、血液系統(tǒng)疾病，惡性腫瘤，風(fēng)濕性疾病，肺纖維化等；(4)曾接受免疫抑制劑、維生素D、抗乙肝病毒治療者；(5)孕婦及哺乳期婦女。兩組入組對(duì)象均簽署知情同意書，并均經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清25(OH)D3水平檢測(cè) 。 兩組試驗(yàn)對(duì)象均禁食8h以上抽取空腹右側(cè)肘靜脈血5ml，室溫靜置半小時(shí)，送檢驗(yàn)科，離心(3 000r/min，離心15min)，采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定血清25(OH)D3水平，試劑盒由德國(guó)羅氏公司提供。25(OH)D3營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的判定標(biāo)準(zhǔn)：25(OH)D3<20ng/ml為缺乏，20ng/ml≤25(OH)D3≤30ng/ml為不足，25(OH)D3>30ng/ml為充足[7]。根據(jù)血清25(OH)D3水平，將100例CHB患者分成3組：25(OH)D3充足組22例、25(OH)D3不足組41例、25(OH)D3缺乏組37例。3組患者在年齡、性別、病程、肝功能Child-Pugh評(píng)分等基線資料方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

1.2.2 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)。抽取各外周靜脈血5ml，采用德國(guó)Partec流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞)分布，同時(shí)分析不同25(OH)D3水平組T淋巴細(xì)胞亞群分布情況。

1.2.3 乙肝兩對(duì)半、HBV-DNA檢測(cè)。 采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定入院對(duì)象乙肝血清學(xué)標(biāo)志物，主要包括乙肝表面抗原、乙肝表面抗體、乙肝核心抗體、乙肝E抗原(HBeAg)、乙肝E抗體，根據(jù)CHB患者血清25(OH)D3水平分組，統(tǒng)計(jì)各組HBeAg陽(yáng)性例數(shù)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CHB患者HBV-DNA載量水平，并統(tǒng)計(jì)不同25(OH)D3水平組HBV-DNA載量水平變化。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和觀察組一般資料對(duì)比 (1)與對(duì)照組比較，觀察組患者血清25(OH)D3水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(2)與對(duì)照組比較，觀察組外周血CD8+比例均升高，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組和觀察組一般資料比較

2.2 不同25(OH)D3組T細(xì)胞亞群、HBV-DNA水平對(duì)比 (1)隨著25(OH)D3水平降低，CHB患者外周血CD8+比例逐漸升高，而CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例均逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。(2)隨著血清25(OH)D3水平降低，CHB患者HBeAg陽(yáng)性率、HBV-DNA載量均逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.3 CHB患者血清25(OH)D3與T淋巴細(xì)胞亞群、HBV-DNA的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示：CHB患者血清25(OH)D3與外周血CD8+細(xì)胞比例、HBV-DNA水平呈明顯負(fù)相關(guān)(r分別為-0.688、-0.812，均P<0.01),與外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞比例呈明顯正相關(guān)(r分別為0.721、0.772、0.639，均P<0.01)。見(jiàn)表3。

表2 不同25(OH)D3組T細(xì)胞亞群、HBV-DNA水平比較

表3 CHB患者血清25(OH)D3與T細(xì)胞亞群、HBV-DNA的相關(guān)性分析

3 討論

維生素D屬脂溶性維生素， 25(OH)D3為其在體內(nèi)的活性形式,其除鈣磷調(diào)節(jié)作用外，研究發(fā)現(xiàn)[8]：其還具有免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化，與慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。而慢性肝病普遍存在25(OH)D3不足或缺乏，F(xiàn)arnik等研究亦發(fā)現(xiàn)[9]：CHB患者25(OH)D3較正常對(duì)照組明顯下降，其缺乏率高(達(dá)81%)，且25(OH)D3水平與乙肝病毒載量呈顯著負(fù)相關(guān)。而本課題組研究發(fā)現(xiàn)：CHB患者血清25(OH)D3水平較健康體檢者明顯降低,且其血清25(OH)D3不足及缺乏率高達(dá)78.0%(78/100)，這與Farnik等結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)CHB患者普遍存在維生素D缺乏。HE等人研究發(fā)現(xiàn)[10]：對(duì)于CHB患者，隨著血清25(OH)D3水平降低，其血HBV-DNA載量反而呈明顯升高趨勢(shì)。本課題組將CHB患者根據(jù)25(OH)D3水平高低進(jìn)行分組發(fā)現(xiàn)：隨著血清25(OH)D3水平降低，CHB患者HBeAg陽(yáng)性率、HBV-DNA載量水平均逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(均P<0.01),這說(shuō)明CHB患者血清25(OH)D3水平與HBV-DNA載量可能存在相關(guān)性，進(jìn)一步采用Pearson相關(guān)分析顯示：血清25(OH)D3水平與HBV-DNA載量存在明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.812，P<0.01)。這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果基本一致[11-12]。

乙型肝炎病毒(HBV)感染發(fā)生率高，機(jī)體感染HBV后，肝臟損害一方面是由于HBV直接損傷肝細(xì)胞，而免疫損傷卻是對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展起決定作用。T淋巴細(xì)胞亞群在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，而CD3+、CD4+、CD8+作為T淋巴細(xì)胞亞群的重要組成部分，其在免疫調(diào)節(jié)功能中起重要作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)[14]：維生素D可以通過(guò)減少CD4+T細(xì)胞的增殖、分化，提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性，從而參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)：與正常對(duì)照組比較，CHB患者外周血CD8+細(xì)胞比較升高，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞比例均降低，與樊海燕等[15]研究結(jié)果一致，說(shuō)明CHB患者機(jī)體免疫功能被打破，免疫損傷為參與CHB的發(fā)生過(guò)程。進(jìn)一步根據(jù)CHB患者血清25(OH)D3水平高低進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)隨著血清25(OH)D3水平降低，外周血CD8+細(xì)胞水平逐漸升高，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞比例逐漸降低，且相關(guān)性分析亦提示CHB患者血清25(OH)D3水平與CD8+細(xì)胞比例呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.688，P=0.004)，與外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例呈明顯正相關(guān)(r分別為0.721、0.772、0.639，均P<0.01)。這說(shuō)明維生素D可能與細(xì)胞免疫存在相關(guān)性，其可能參與了CHB患者免疫損傷調(diào)節(jié)過(guò)程。這為臨床上治療CHB患者提供了新的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，CHB患者25(OH)D3不足及缺乏率高，其外周血CD8+比例升高，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例均降低，且血清25(OH)D3水平與HBV-DNA、外周血CD8+細(xì)胞比例呈明顯負(fù)相關(guān)，與外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例呈明顯正相關(guān)。然而，由于課題經(jīng)費(fèi)受限，本課題組亦存在不足，即未進(jìn)一步探討維生素D參與CHB免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制。下一步本課題組將從基因水平、蛋白水平及細(xì)胞通路水平探討其機(jī)制，并擬探討外源性補(bǔ)充維生素D是否可提高其抗病毒效果，延緩CHB病情進(jìn)展。