三氧化二砷對前列腺癌移植瘤GSTP1基因去甲基化作用的研究

常 琳

鄭州大學附屬腫瘤醫院ICU， 河南省鄭州市 450000

前列腺癌是男性泌尿系統常見的惡性腫瘤，在我國的發病率呈逐漸上升趨勢，死亡率亦較高[1]；但隨著生活方式的改變、人口老齡化及腫瘤篩查的普及，前列腺癌在我國的發病率亦呈直線上升，且發現時多已是中晚期，因此其發病機制逐漸引起重視。

谷胱甘肽-S-轉移酶作為一種多功能二聚體同工酶家族，具有催化解毒的作用，可將致癌物排出，其包含A、M、T、P四個亞家族，而谷胱甘肽-S-轉移酶P1(GSTP1)就是P亞家族中的一員，它在抗腫瘤、抗細胞損傷的過程中發揮著重要作用[2]。有研究表明，GSTP1基因甲基化的異常致使GSTP1基因失去活性,而這種失活對肝癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌和前列腺癌等多種腫瘤的發生、發展都起著至關重要的作用。隨著研究的逐漸深入，發現DNA甲基化的過程是可逆的，可通過相關手段使DNA去甲基化而恢復表達，成為了腫瘤治療的新方法[3]。本文旨在探討三氧化二砷(As2O3)對前列腺癌移植瘤GSTP1基因的甲基化狀態的影響及可能相關的機制，為前列腺癌治療的研究提供新的思路、方向及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人前列腺癌細胞株DU145于中科院上海細胞庫購買；30只Balb/c(nu-/nu-)雄性裸鼠于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買；動物RNA、DNA提取試劑盒、甲基化修飾試劑盒分別于北京鼎國昌盛、Epigentek公司購買；反轉錄試劑盒購于Thermo Scientific公司；兔抗GSTP1單克隆抗體、免疫組化SP-0023試劑盒均購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及裸鼠模型建立：前列腺癌DU145細胞用PRMI-1640培養液于細胞培養箱(T 37℃,5% CO2)中常規培養；取對數生長期細胞，加胰酶消化液消化成單細胞懸液，注射于接種裸鼠的右前肢靠近腋窩處的背部皮下，1周左右時間接種腫瘤細胞部位開始呈現硬結改變，隨時間逐漸長大，即成功建立前列腺癌移植瘤的模型，100%成瘤。

1.2.2 模型的分組、處理：2周后去除瘤體過大或過小的裸鼠，留下大小一致、形狀規則的28只裸鼠，隨機分為4組，每組7只(剪耳做標記)：給藥前稱重，每組均給藥3周。空白對照組：腹腔注射：0.2ml生理鹽水+灌胃：0.2ml三蒸水，1次/d；比卡魯胺組：腹腔注射：0.2ml生理鹽水+灌胃：0.2ml比卡魯胺(23mg/kg)，1次/d；As2O3組：腹腔注射：0.2ml As2O3(3mg/kg)+灌胃：0.2ml三蒸水，1次/d；As2O3+比卡魯胺組：腹腔注射：0.2ml As2O3(3mg/kg)+灌胃：0.2ml比卡魯胺(23mg/kg)，1次/d。用藥結束后的第2天脫臼處死裸鼠，并將腫瘤組織完整的解剖處理，稱重，并放入液氮中保存，裸鼠尸體由實驗動物中心集中處理。

1.2.3 RT-PCR檢測：根據總RNA提取試劑盒提供的步驟來提取總RNA ,然后根據反轉錄試劑盒提供的步驟吸取1μg RNA 反轉錄為cDNA,取50μl反應體系(2×Taq PCR Green Mix 25μl、cDNA 3μl、引物F 1μl、引物R 1μl、DDH2O 20μl)進行RT-PCR。β-actin 引物序列：F:5’-AGGCATTGTGTGATGGACTCCG-3’;R:5’-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3’,產物大小301bp；GSTP1 引物序列：F:5’-TCCAATACCATCCTGCGTCAC-3’;R:5’-ATCCTTGCCCGCCTCATAG-3’,產物大小156bp；冰上操作，反應條件為：94℃預變性3min、94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，共35個循環，產物放置4℃保存。取5μl產物，加樣于2.0%瓊脂凝膠中進行電泳，并觀察分析凝膠成像。

1.2.4 MSP檢測：據DNA提取試劑盒步驟提取總DNA,取4μg DNA按DNA甲基化修飾試劑盒步驟操作，得到甲基化修飾的DNA;50μl反應體系(2×Taq Master Mix 25μl、DNA 模板1μl、引物F 2μl、引物R 2μl、DDH2O 20μl)中進行MSP；uGSTP1引物序列：F:5’-GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3’;R:5’-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3’,產物大小97bp;mGSTP1 引物序列：F:5’-TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC-3’;R:5’-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’,產物大小93bp。冰上操作，反應條件為：94℃預變性2min、94℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共35個循環，72℃終延伸2min，產物于4℃保存。取5μl產物，同樣于2.0%瓊脂凝膠中進行電泳，觀察分析凝膠成像。

1.2.5 免疫組化檢測：按免疫組織試劑盒提供的步驟進行操作，檢測四組移植瘤組織GSTP1蛋白質的表達情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件進行數據處理，統計學差異的比較采用方差分析，α=0.05為顯著性檢驗水準。以P<α為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 As2O3誘導GSTP1 mRNA 的重新表達 空白對照組和比卡魯胺組無目的基因條帶出現，而As2O3組和As2O3+比卡魯胺組均出現相應的目的條帶(156bp)；分析兩組基因條帶的灰度值(采用Image J軟件系統)：As2O3組為：0.852；As2O3+比卡魯胺組為：0.834；兩組條帶灰度差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 As2O3對四組標本mRNA的作用

1-空白對照組；2-比卡魯胺組；3-As2O3組；4-As2O3+比卡魯胺組

2.2 As2O3對GSTP1 DNA 的去甲基化作用 GSTP1甲基化陽性條帶為93bp，去甲基化陽性條帶為97bp，空白對照組和比卡魯胺組出現明顯的甲基化陽性條帶，未出現明顯的去甲基化陽性條帶；而As2O3組和As2O3+比卡魯胺組均出現明顯的去甲基化陽性條帶；分析兩組去甲基化條帶的灰度值(采用Image J軟件系統)：As2O3組為：0.685；As2O3+比卡魯胺組為：0.702；兩組的去甲基化條帶灰度差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 As2O3對四組標本DNA的去甲基化作用

m-甲基化條帶，u-去甲基化條帶；1-空白對照組；2-比卡魯胺組；3-As3O2組；4-As3O2+比卡魯胺組

2.3 As2O3誘導GSTP1蛋白的重新表達 400倍顯微鏡下，隨機選擇每張玻片的5個視野進行觀察，每個視野中隨機選擇出100個細胞：陽性細胞判定標準為胞核或胞漿中染色出棕黃色顆粒；通過評分半定量分析法來判定組織陽性程度，即將陽性細胞的百分數計分×染色強度的計分=蛋白的相對表達量。其中，陽性細胞的百分數計分標準為：0分：陽性細胞百分比<10%；1分：陽性細胞百分比11%～25%；2分：陽性細胞百分比26%～50%；3分：陽性細胞百分比51%～75%；4分：陽性細胞百分比>75%。染色強度的計分標準為：0分：無色，1分：淡黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色。蛋白相對表達量總分：強陽性(+++)：9～12分；中等陽性(++)：5～8分；弱陽性(+)：2～4分，陰性(-):0～1分。實驗結果為：空白對照和比卡魯胺組均為陰性(0分)，As2O3組和As2O3+比卡魯胺組均為陽性(9分)。見圖3。

3 討論

DNA甲基化是研究相對清楚的一種表觀遺傳學修飾機制，而DNA的異常甲基化可導致惡性腫瘤的發生，其主要機制可能為其激活或抑制了細胞周期、細胞生長及細胞凋亡相關的基因。DNA的異常甲基化可成為監控惡性腫瘤生長的潛在生物標志物，多種研究中已證實其與基因損失修復、調控細胞周期、激素相關反映、腫瘤的發生發展、浸潤轉移等多個方面密切相關[4-6]。有研究發現在前列腺癌中，DNA CpG島甲基化導致了啟動子的失活及基因沉默，如COX-2、ER、MDR1、hMLH1等的甲基化[7-10]。在前列腺癌中，很多基因功能喪失的主要或者唯一的機制可能就是DNA異常甲基化[11]。GSTP1作為一種解毒酶，是谷胱甘肽-S-轉移酶家族中的重要成員，它在抗細胞損傷、抗腫瘤方面具有極其重要的作用。它的異常甲基化可導致GSTP1基因的失活，各種致瘤因素因此更容易攻擊前列腺中正常的上皮細胞，使其癌變，同時腫瘤細胞亦會受到某些因素的攻擊，導致進一步惡性進展[12]。同時研究表明，DNA甲基化這種表觀遺傳學事件具有可逆性，此特性使其成為藥物治療新的研究方向，以期通過某些藥物作用不同程度的減少甚至消除DNA異常甲基化，從而來治療惡性腫瘤。

圖3 As2O3對四組標本蛋白質表達的作用

A:空白對照組(×400倍),B:比卡魯胺組(×400倍),C:As2O3組(×400倍),D:As2O3+比卡魯胺組(×400倍)

As2O3抗腫瘤的作用涉及多方面，隨著研究的不斷深入，其中在DNA去甲基化方面具有良好的應用前景。本實驗建立裸鼠前列腺癌移植瘤模型，分別采用RT-PCR、免疫組化法檢測四組瘤組織標本中GSTP1 mRNA和蛋白質的表達情況，采用MSP觀察As2O3對GSTP1基因的去甲基化作用。本研究中，空白對照和比卡魯胺兩組的GSTP1 mRNA、蛋白質表達均為陰性，且對GSTP1 基因未表現出明顯的去甲基化作用，而As2O3和As2O3+比卡魯胺兩組的GSTP1 mRNA、蛋白質表達均為陽性，且兩組表達的mRNA陽性條帶灰度值差異無統計學意義(P>0.05)；同時對GSTP1基因均表現出明顯的去甲基化作用，且兩組去甲基化陽性條帶灰度值差異無統計學意義(P>0.05)；表明發揮去甲基化作用的藥物為As2O3，比卡魯胺組未出現目的條帶說明其無DNA去甲基化作用。從而得出結論：一定劑量的As2O3具有逆轉前列腺癌移植瘤GSTP1 DNA甲基化狀態的作用，并能誘導GSTP1 mRAN和蛋白質的重新表達；為前列腺癌的治療提供了新的方向和實驗理論依據。本實驗僅是As2O3去甲基化作用研究的一部分，其具體作用機制和臨床應用仍有待進一步深入的研究。