超聲波對花生粕蛋白功能特性及結構特性的影響

張艷艷 王冰蕊 張少可 李銀麗 張 華

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院;食品生產與安全河南省協同創新中心;河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，鄭州 450002)

花生蛋白在壓榨提取花生油的過程中發生嚴重熱變性，進而導致花生蛋白的營養價值降低，功能特性也降低，這極大地限制了花生粕在其他領域的應用，花生粕資源浪費嚴重。植物蛋白的功能特性是指蛋白質本身具有能影響食品質量的物理性質和化學性質。主要包括起泡性、乳化性、持水性、吸油性、溶解性等。這些特性除了與氨基酸組成、分子大小和結構形態等屬性有關外，還與蛋白質相互作用的組分和其所在環境等有關。物理改性是指改變蛋白分子間的聚集方式和蛋白質的高級結構。這種方法具有無毒，可接受性高的特點，因此更廣泛的被應用到食品領域。

超聲波是一種快速無損的物理加工方法，超聲波的空化作用，機械作用及定向作用可有效增強物料的傳質傳熱，加速其化學反應的進行。Zhang等[1]研究發現超聲波處理后，花生分離蛋白的乳化性得到了明顯的改善，并且蛋白分子的平均直徑由474.70 nm減少到255.80 nm。超聲波處理可盡量減少花生蛋白三級空間結構的變化。邵悅等[2]研究了不同超聲波處理時間和對花生蛋白功能特性的影響，研究發現，不同的超聲波處理時間對花生蛋白的功能影響效果不同，超聲波處理5～20 min后，花生蛋白的起泡性、泡沫穩定性、乳化性、吸油性和溶劑性都得到了一定的改善。

研究證實，超聲波的作用效果與其工作模式直接相關，不同工作模式的超聲波對物料的結構的影響具有較大差異[3, 4]。

本研究以熱榨花生粕為主要原料，研究了探頭式、平板式、平板式協同探頭式超聲波對花生粕蛋白功能特性的影響，并對其蛋白結構進行表征，以期揭示不同模式超聲波對花生粕蛋白功能特性的改良機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

熱榨花生粕：周口魯花濃香花生油有限公司；金龍魚大豆植物油：上海嘉里食品工業有限公司；三羥甲基氨基甲烷；甘氨酸；乙二胺四乙酸；5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)；8-苯胺-1-萘磺酸：麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純或優級純。

1.2 花生粕蛋白的制備及多模式超聲波的處理

1.3 花生粕蛋白功能特性的測定

1.3.1 花生粕蛋白起泡性及泡沫穩定性測定

根據馬勇等[6]的方法進行。根據式(1)計算花生粕蛋白的起泡性，再根據式(2)計算其泡沫穩定性。

(1)

(2)

1.3.2 花生粕蛋白的乳化性及乳化穩定性測定

參考李維遙等[7]的方法進行，取20 mL的蛋白溶液倒入燒杯中,再加入等體積的20 mL大豆植物油混勻。均質2 min,轉速為10 000 r/min,取20 mL于50 mL離心管中，配平后進行離心，離心力設定為1 750 g,離心時間設定為5 min。借助直尺進行讀數，并記錄液體總高度和乳化層高度。再將測量后的離心管放置在60 ℃的水浴鍋中，恒溫放置30 min后取出，待冷卻至室溫后，再次進行離心，離心力設定為1 750 g,離心時間設定為5 min,最后再借助直尺測量離心管中乳化層的高度。根據式(3)計算花生粕蛋白的乳化性，再根據式(4)計算乳化穩定性。

(3)

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(4)

1.3.3 花生粕蛋白的溶解性、吸油性和持水性的測定

參考文獻[2]中的方法進行。

1.4 花生粕蛋白結構特性的測定

1.4.1 紫外光譜和熒光光譜的掃描

將200 mg花生粕蛋白粉溶解在15 mL的磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L, pH為7.0)中離心(4 670 g)10 min，離心后棄去沉淀。取0.5 mL的蛋白上清液稀釋至12倍，用紫外分光光度對其進行光譜掃描[8]。紫外掃描參數為：掃描范圍200～400 nm，掃描速度 60 nm/min，光程 1.0 cm，狹縫寬度0.2 nm。熒光掃描參數為：激發波長290 nm，掃描范圍：300～400 nm，掃描速度240 nm/min，激發和發射的狹縫寬度5 nm[9]。

1.4.2 紅外光譜掃描及二級結構的測定

準確稱量0.002 g的花生粕蛋白粉樣品，加入KBr 0.018 g，充分混勻后用研缽將混合物研磨成粉末，將混合粉末壓制成薄片。利用傅里葉紅外光譜掃描儀，對壓制好的薄片進行波段掃描，波段掃描的范圍設定在4 000～400 cm-1，掃描次數設定為32。每個樣品做3次平行試驗[10]。在1 600～1 700對蛋白二級結構單元含量的分析參照[11]等的方法。

1.4.3 花生粕蛋白的巰基含量測定

取200 mg花生粕蛋白粉于50 mL的離心管中，倒入15 mL的Tris-Gly緩沖液(0.086 mol/L Tris，0.090 mol/L Gly，4 mmol/L EDTA，pH 8.0)，漩渦震蕩提取30 min,然后進行離心，離心力設定為5 836 g,離心時間設定為20 min，離心后取上清液1 mL加入表面包有避光材料的10 mL的離心管中，再加入5 mL由8 mol/L的尿素和0.5%的EDTA(用Tris-Gly緩沖液配制)配制的溶液，最后加入50 uL的Ellman’s試劑(由4 mg的DTNB試劑溶于1 mL的Tris-Gly緩沖液配制成的Ellman’s試劑)，充分搖勻，至于30 ℃水浴鍋中反應1 h,用分光光度計在412 nm處測定吸光度值。根據吸光度值計算出巰基含量[12]。根據式(5)計算巰基含量。

(5)

1.5 熱特性的檢測

參照Meng等[13]的方法進行。

1.6 數據分析

數據分析采用Origin 8.5、PeakFit v4.12、及Excel等軟件。

2 結果與分析

2.1 超聲波對花生粕蛋白功能性特性的影響

由表1所示，不同工作模式的超聲波處理后，花生粕蛋白各項功能特性發生了顯著變化。對于蛋白的起泡性，乳化性和持油性，效果最優的是平板+探頭式超聲波。與對照樣品相比分別增高了15.0%、62.9%和7.0%。對于蛋白的泡沫穩定性、乳化穩定性、溶解性和持油性，效果最好的探頭式超聲波。與對照樣品相比分別增高了8.1%、24.3%、5.1%、23.8%。

表1 超聲波對花生粕蛋白功能特性的影響

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。

不同的超聲波作用方式，對蛋白不同的結構單元影響會不同，造成了功能特性也會有不同的變化。平板式超聲波作用均勻，但是其在物料分子之間的穿透力度不夠。探頭式超聲波穿透能力強，但是其波形是自上而下的駐波，作用范圍有限且分布不均。對于蛋白的溶解性，探頭式超聲波作用力集中，使蛋白顆粒破裂，粒徑變小，表面積增大，有利于維持原來有序結構的次級鍵打開，溶解度提高。對于蛋白的乳化性，蛋白分子更容易在均勻超聲場的誘導下產生極化現象，使維持蛋白空間結構的非共價鍵(疏水相互作用、二硫鍵、靜電相互作用)被破壞，蛋白分子部分展開，分子的柔性提高，更多的蛋白分子結合到油-水界面[14,15]。同時，蛋白分子內部的疏水殘基暴露在蛋白表面，蛋白表面的疏水性增強，故蛋白的乳化活性增強，因此平板式+探頭式超聲波優勢更為明顯。

2.2 超聲波對花生粕蛋白結構特性的影響

天然的花生蛋白具有較好的起泡性、乳化性、吸油性、持水性和溶解性等功能特性，花生粕蛋白功能特性劣變的主要原因為高溫壓榨時花生蛋白質發生了熱變性。為了揭示超聲波對花生粕蛋白功能特性的改良機制，分別研究了不同超聲波工作模式對花生粕蛋白紫外、熒光光譜特性、蛋白二級結構、巰基含量和表面疏水性的影響。

2.2.1 紫外光譜和熒光光譜

由圖1a可以看出，經過超聲波處理后，紫外最大吸收波長發生了藍移。這是因為經過超聲波處理后，花生粕蛋白質子解聚展開產生了新的亞基，從而使得紫外最大吸收波長發生了藍移。同時也能夠表明多模式超聲波處理后，花生粕蛋白分子的展開程度變大，分子表面具有紫外吸收的殘基可能增多。對于花生粕蛋白的紫外光譜特性，改變最大的是探頭式超聲波。由圖1b可以看出，經過多模式超聲波處理后，花生粕蛋白的熒光最大吸收峰位發生了顯著性的偏移。與對照組相比，探頭式超聲波處理的花生粕蛋白的熒光最大吸收峰偏移最顯著。最大吸收峰位紅移表明分子結構的展開，同時展現為分子內部色氨酸殘基的逐漸暴露[16]。實驗數據顯示，多模式超聲波處理后的花生粕蛋白的峰位在紅移，表明花生粕蛋白的結構在不斷展開，分子內部的色氨酸殘基在逐漸暴露。這說明超聲波會導致花生粕蛋白的聚集和結構的變化，且探頭是超聲波的作用效果最為顯著。

圖1 超聲波對花生粕蛋白紫外光譜和熒光光譜的影響

2.2.2 巰基含量

由圖2所示，多模式超聲波處理后的花生粕蛋白的巰基含量發生了明顯的變化。其中，改善效果最好的是平板式超聲波，增高了20.3%。探頭式超聲波對其影響不大。平板+探頭式超聲波處理后，巰基含量下降，與對照組相比，下降了8.5%。經過一定方式處理后，蛋白質分子結構會發生伸展變性，繼而引起二硫鍵含量和巰基含量的變化。巰基含量的上升就是因為蛋白結構改變，而蛋白內部結構展開使得內部巰基暴露，蛋白的亞基發生解離和二硫鍵斷裂生成巰基，這些都有可能帶來這種改變。巰基含量降低是因為巰基氧化、SH和S-S交換導致二硫鍵的形成[17]。因此，平板式超聲波可能導致花生粕蛋白內部結構展開，從而使內部巰基暴露，使得總巰基含量變高；而平板+探頭式超聲波可能導致巰基和二硫鍵之間形成了交換，使得巰基向二硫鍵轉變，導致總巰基含量降低。

圖2 超聲波對花生粕蛋白巰基含量的影響

2.2.3 蛋白二級結構

本次實驗利用多模式超聲波對花生粕蛋白進行處理，通過傅里葉紅外掃描儀對樣品進行4000～400 nm波段掃描，得到了紅外吸收光譜圖如圖3。對其酰胺Ⅰ帶進行分峰擬合之后得到表4。

表2所示，超聲波處理顯著改變了花生粕蛋白的二級結構。對于α-螺旋、β-轉角和β-折疊，平板+探頭式和探頭式超聲波對其相對百分含量影響效果最為顯著，但兩者之間并無顯著差別。對于無規則卷曲結構，三種模式的超聲波處理并無顯著差別。花生粕蛋白中的α-螺旋結構和β-轉角結構的相對百分含量有明顯的上升，而β-折疊結構和無規則卷曲結構的相對百分含量在下降。超聲波造成β-折疊結構的氫鍵斷裂和無規則卷曲結構的聚集結構解離，導致兩者百分含量下降，進而轉化為α-螺旋結構和β-轉角結構，造成后兩者百分含量上升[19]。

表2 超聲波對花生粕蛋白中二級結構的影響

圖3 紅外光譜圖

2.3 超聲波對花生粕蛋白熱力學特性的影響

在表3中，Td是蛋白質熱穩定性的代表，Td值越大，代表蛋白熱穩定性越高，經過平板式超聲波處理后的花生粕蛋白的Td值最大，因此其熱穩定性最好。ΔH代表焓變，反映熱變性程度，ΔH值越小，熱變性程度越低。平板+探頭式超聲波處理后的花生粕蛋白的ΔH最小，其熱變性程度最低，與對照樣品相比，降低了8.6%。ΔH還能反映蛋白質的疏水性，同時也反映的是蛋白質分子的聚集程度，ΔH越高，代表疏水性越小，聚集程度越大?？芍?，平板+探頭式超聲波處理的花生粕蛋白的疏水性變大。在表5中還有兩個參數就是Ta初始溫度，Tc終止溫度，這兩者的差值代表著峰的寬窄。峰的寬窄可用來說明變性轉變的協同性，峰越窄，說明協同性越高[20-22]?？芍N超聲波模式中，平板式超聲波處理后的花生粕蛋白的Tc-Ta值最小，說明平板式超聲波處理后的花生粕蛋白的協同性最高。

圖4 DSC譜圖

工作模式Ta/ ℃Tc/ ℃Tc-Ta/ ℃Td/ ℃ΔH/J/g對照142.28182.7740.49146.14643.10平板151.92195.5942.67162.59641.94探頭144.45195.3250.87148.55658.26平板+探頭145.95194.5248.57159.20588.03

注：Ta是初始溫度，Tc為終止溫度，Td為峰值溫度，ΔH為變性焓值。

3 結論

本文研究了探頭式、平板式和平板協同探頭式超聲波處理對花生粕蛋白功能特性及蛋白結構的影響。結果顯示，超聲波可以顯著改善花生粕蛋白的功能特性。對于蛋白的起泡性，乳化性和持油性，效果最優的是平板+探頭式超聲波，與對照樣品相比分別增高了15.0%、62.9%和7.0%。對于蛋白的泡沫穩定性、乳化穩定性、溶解性和持油性，效果最好的探頭式超聲波。與對照樣品相比分別增高了8.1%、24.3%、5.1%和23.8%。超聲波處理后，花生粕蛋白的分子結構有明顯的改變。紫外光譜結果表明：超聲對花生粕蛋白分子構象有改變，紫外最大吸收波長發生了藍移，熒光最大吸收峰明顯的指示峰位在紅移，蛋白的結構在不斷展開，分子內部的色氨酸殘基逐漸暴露，超聲波導致花生粕蛋白的聚集和結構的變化。探頭式、平板+探頭式超聲波對α-螺旋、β-轉角和β-折疊的相對百分含量的影響最大，但兩者無顯著差別；平板式超聲波顯著提高了花生粕蛋白的巰基含量，與對照樣品相比提高了20.6%；熱力學特性的結果顯示，探頭式超聲波處理后的焓變最小，與對照樣品相比下降了8.6%。超聲波處理通過改變花生粕蛋白的分子結構改善其功能特性，降低其熱變形的程度。