江口蘿卜豬STAT3基因多態性及生物信息學分析

吳雪 張繼 邱淦遠 楊茂林 劉若余

摘要：【目的】明確堿基突變對江口蘿卜豬STAT3基因mRNA二級結構及其編碼蛋白二、三級結構的影響，為更好地開發利用江口蘿卜豬種質資源打下基礎。【方法】利用江口蘿卜豬血樣提取基因組DNA構建DNA池，采用混合DNA池結合PCR產物直接測序的方法對STAT3基因進行多態性分析，篩選出SNP多態位點及估算等位基因頻率，并進行生物信息學分析。【結果】從江口蘿卜豬血樣中擴增獲得STAT3基因的24個外顯子，并篩選出7個SNPs位點，分別是：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A。其中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A為同義突變，不改變其編碼氨基酸序列;Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A為錯義突變，會導致其編碼氨基酸發生改變。Exon22-C43>A突變后致使最小自由能降低為 -755.90 kcal/mol，結構穩定性增強;Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突變均促使最小自由能增加，分別為 -754.00、-753.40和-752.60 kcal/mol，且導致mRNA二級結構改變，結構穩定性降低，其中Exon5-G57>A突變導致mRNA二級結構完全改變。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A突變均可導致編碼蛋白二、三級結構的改變，具體表現為α-螺旋增加、β-折疊減少，而無規則卷曲除Exon2-A19>C突變呈增加趨勢外，其他突變均呈減少趨勢。其中，Exon2-G20>C突變對蛋白二級結構影響最大，而Exon2-A19>C突變的影響最小。【結論】從江口蘿卜豬STAT3基因的24個外顯子上檢測出7個SNPs位點，其中Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4個為錯義突變，除了造成編碼氨基酸改變外，還導致mRNA及編碼蛋白二、三級結構的改變，進而可能對STAT3蛋白的功能造成影響。

關鍵詞： 江口蘿卜豬;STAT3基因;SNP位點;錯義突變;生物信息學

中圖分類號： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0461-07

0 引言

【研究意義】江口蘿卜豬是貴州省的優良地方豬種之一，主要分布于貴州銅仁市江口縣及其毗鄰的松桃和碧江等縣，具有耐粗飼、適應性強、肉質細嫩等特點，深受當地群眾的喜愛（燕志宏等，2010），但江口蘿卜豬存在生長緩慢、瘦肉率低等缺陷（毛同輝等，2015）。信號轉導及轉錄激活因子（Signal transducers and activators of transcription，STAT）是胞質中的調控因子，也是一種調控蛋白，具有N端片段保守序列、DNA結合區、SH2結構域、SH3結構域和C端轉錄激活區等功能區域（Isozaki et al.，2008）。JAK-STAT通路是細胞中的重要信號通路，負責調控多種細胞因子，包括生長激素等相關基因（Richard and Stephens，2011;Clifford and Ward，2013）。因此，深入研究STAT對江口蘿卜豬生長發育的調控機制，對利用分子輔助選育改良品種缺陷具有重要意義。【前人研究進展】STAT蛋白主要位于胞質中，當細胞因子與細胞膜上的受體結合，促使與受體偶聯的JAK活化，繼而結合STAT蛋白使其發生磷酸化修飾，活化STAT蛋白以二聚體的形式進入細胞核與靶基因結合，從而調控基因轉錄（Khatib et al.，2009;Wang and Huang，2010）。STAT蛋白家族總共有7個成員，分別是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6（Kaplan，2013）。其中，STAT3是一種存在于細胞質中并在酪氨酸磷酸化信號通路中發揮關鍵作用的功能蛋白，也是一種細胞核轉錄因子，依賴于細胞因子或生長因子等配體的激活而調控基因表達（Buettner et al.，2002）。STAT3可與STAT1形成異源二聚體或自成同源二聚體進入細胞核與靶基因啟動子結合，而調節基因表達（Herrington et al.，2000）。STAT3最早被發現作為IL-6信號傳遞過程中的中介因子調控免疫反應（Hirano et al.，2000），近年來諸多研究相繼報道了STAT3的其他生理功能，如對肝臟快速反應蛋白的調控作用（Subramaniam et al.，2013），敲除STAT3基因導致早期胚胎死亡等（Ohkubo et al.，2013）。STAT3基因在瘦素介導下對生物體的能量平衡也具有一定作用（Wallenius et al.，2002;于月等，2013）。郭弈瑞（2014）研究表明，STAT3基因多態性與肥胖易感性具有一定的相關性;馬祖亮（2014）也研究發現，我國漢族人群中STAT3基因多態性具有影響超重、肥胖和脂類代謝紊亂的潛力。此外，STAT3蛋白可作為轉錄因子參與生長激素等調節過程，從轉錄水平上調節基因表達，繼而調控動物的生長發育。馬佩云（2010）以健康的雄性昆明小白鼠骨骼肌細胞為研究對象，分別采用AG490和IL-11進行處理，從細胞水平上證明JAK2-STAT3信號通路會對骨骼肌發育和能量代謝相關基因表達產生影響。【本研究切入點】目前，有關STAT3基因在人類及結合JAK-STAT信號通路的研究較多，但STAT3基因在豬等家畜中的相關研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】構建江口蘿卜豬DNA池后直接測序分析，然后運用DNASTAR等在線軟件分析篩選出SNP多態位點及估算等位基因頻率，并進行生物信息學分析，明確堿基突變對江口蘿卜豬STAT3基因mRNA二級結構及其編碼蛋白二、三級結構的影響，為更好地開發利用江口蘿卜豬種質資源打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 DNA提取及DNA池構建

56頭江口蘿卜豬血樣均采自貴州江口縣，采用Ezup柱式基因組提取試劑盒（血液）提取基因組DNA。基因組DNA以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，DNA濃度使用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計進行測量，每個樣本重復3次。將所有樣本DNA濃度調整至100 ng/μL，然后各取5.0 μL混合，構建DNA池。

1. 2 引物設計合成及PCR擴增

參考NCBI上已公布的豬STAT3基因序列（GenBank登錄號NC_010454.4），運用Primer Premier 5.0設計15對特異性引物，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，各引物序列及其最適退火溫度等信息見表1。PCR反應體系20.0 μL：2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，退火30 s、72 ℃ 30 s，進行35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 3 測序分析及等位基因頻率估算

選擇1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后條帶單一且明亮清晰的PCR擴增產物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。測序結果采用DNASTAR中的SeqMan分析測序峰圖，并與參考序列進行比對以篩選出SNP位點。同時，采用MWSnap v3.0測量等位基因對應的峰高，根據公式Ai=Bi/（B1+B2）估算等位基因頻率。

1. 4 生物信息學分析

采用RNAfold（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）預測單核苷酸突變前、后mRNA二級結構;運用PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）預測突變前、后編碼蛋白二級結構，并以SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）預測突變前、后編碼蛋白三級結構。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增結果

以基因組DNA為模板，通過PCR分別擴增獲得江口蘿卜豬STAT3基因的24個外顯子（Exon）片段，部分擴增產物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。清晰觀察到圖譜中的條帶單一、明亮清晰，且無拖帶等現象，說明擴增效果好，與預期效果相符。

2. 2 測序分析結果

擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，然后通過DNASTAR和BLAST等在線分析軟件與參考序列進行比對分析，發現其高度同源性，并篩選出7個SNPs位點。將各外顯子的第1個堿基定義為+1，則這7個SNPs位點分別為：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A。其中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A為同義突變，不會引起編碼氨基酸改變，但由于存在簡并密碼子且使用頻率不同，也可能會導致基因的表達差異;Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A為錯義突變，可導致其mRNA編碼氨基酸改變，具體表現（表2）：Exon2-A19>C突變導致絲氨酸突變為精氨酸（Ser→Arg），Exon2-G20>C突變導致絲氨酸突變為蘇氨酸（Ser→Thr），Exon5-C64>A突變導致谷氨酰胺突變為賴氨酸（Gln→Lys），Exon22-C43>A突變導致脯氨酸突變為谷氨酰胺（Pro→Gln）。

2. 3 等位基因頻率估算結果

采用MWSnap v3.0測量江口蘿卜豬STAT3基因各SNP位點對應的峰高，計算出等位基因頻率。由表2可看出，2號外顯子（Exon2）上存在3個突變位點，且突變頻率均較高，而其他幾個外顯子上的突變頻率較低，說明相對于外顯子2，其他外顯子可能更加保守。

2. 4 生物信息學分析結果

2. 4. 1 mRNA二級結構預測結果 采用RNAfold預測江口蘿卜豬STAT3基因突變前后各基因型mRNA二級結構。Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon22-C43>A突變均未導致mRNA二級結構發生改變，僅Exon22-C43>A突變后致使最小自由能降低為-755.90 kcal/mol，結構穩定性增強，而其他3個突變致使最小自由能分別增加至-754.00、 -754.60和-750.10 kcal/mol，導致結構穩定性降低。Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突變均促使最小自由能增加，分別為-754.00、-753.40和-752.60 kcal/mol，且導致mRNA二級結構改變，結構穩定性降低，其中，Exon5-G57>A突變導致mRNA二級結構完全改變，可能對蛋白翻譯有明顯影響。

2. 4. 2 編碼蛋白二級結構預測結果 采用PredictProtein對江口蘿卜豬STAT3基因不同基因型編碼蛋白二級結構進行預測，結果（表3）表明，Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A突變均會導致編碼蛋白二級結構的改變，具體表現為α-螺旋增加、β-折疊減少，而無規則卷曲除Exon2-A19>C突變呈增加趨勢外，其他突變均呈減少趨勢。其中，Exon2-G20>C突變對編碼蛋白二級結構影響最大，而Exon2-A19>C突變的影響最小。

2. 4. 3 編碼蛋白三級結構預測結果 利用SWISS-MODEL對江口蘿卜豬STAT3基因不同基因型編碼蛋白三級結構進行預測。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A、E-xon22-C43>A突變均會導致編碼蛋白三級結構發生改變。

3 討論

STAT蛋白家族是JAK-STAT信號通路中的重要調控因子，調控著多種細胞因子信號通路（Kaplan，2013）。STAT3是其中的重要一員，對生物的生長發育起重要調控作用。許多細胞因子受體，如表皮生長因子受體（EGFGR）、血管內皮生長因子受體（VEFGR）等均可促進STAT3活化，而參與生長調節過程（Chung et al.，2017）。當IL6和IL10等細胞因子與靶細胞表面受體結合后，此時受體還能結合同源或異源的寡聚蛋白，同時激活與其偶聯的JAKs;隨后激活的JAKs可促使STAT3蛋白C端的酪氨酸殘基磷酸化，進而形成同源二聚體或與STAT1形成異源二聚體進入細胞核，與其他轉錄因子相互作用共同調節基因轉錄表達（宋舟等，2012）。STAT3在早期胚胎腦發育階段高度表達，但后期表達呈下調趨勢。早期STAT3基因高度表達有利于內源性神經干細胞的增殖和穩定，后期表達下調則可促進相鄰細胞的神經元分化（Zhao et al.，2016）。此外，受外部刺激時，STAT3信號通路被激活并激發其C端酪氨酸705區磷酸化，提高運動神經元六聚物在STAT3信號通路上游信號的轉錄活動，而增強運動神經元六聚物的表達（Lee et al.，2013），說明STAT3基因對運動神經元的發育也有調控作用。楊永強等（2013）以務川黑牛和貴州荷斯坦奶牛構建DNA池并擴增STAT3基因啟動子，篩選出7個SNPs位點，發現Promoter322-A>G可能是影響肉牛生長性狀的重要功能性SNP位點;Tripathi等（2017）發現STAT3是調控人類Th17細胞早期分化的關鍵因子。可見，STAT3基因的研究不僅在疾病治療及預防上具有很高價值，還有助于揭示其對動物生長發育的作用機制。

本研究利用江口蘿卜豬血樣提取基因組DNA構建DNA池，首次從江口蘿卜豬血樣中擴增獲得STAT3基因的全部外顯子，并篩選出7個SNPs位點：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4- T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A，分別位于第2、4、5和22號外顯子上，其余外顯子均未檢測到SNP位點。說明其他外顯子相較于這4個外顯子可能更加保守，突變頻率更低，也可能由于樣本容量較小所致，具體原因有待進一步研究證實。在這7個SNPs位點中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A為同義突變，Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A為錯義突變。本研究還發現，外顯子2上3個突變位點的突變頻率均最高，說明其他外顯子相對更加保守。此外，通過預測堿基突變前后的mRNA二級結構，發現只有Exon22-C43>A突變后致使最小自由能減小為-755.90 kcal/mol，結構穩定性增強，其他突變則導致最小自由能增加，穩定性減弱，尤其是Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突變導致mRNA二級結構改變，且有可能對STAT3蛋白的翻譯造成影響。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4個錯義突變還會導致編碼蛋白二級結構發生改變，如α-螺旋增加、β-折疊減少等，對編碼蛋白三級結構也有一定影響，但這些變化對STAT3蛋白的功能是否產生影響還有待進一步探究。

本研究從江口蘿卜豬STAT3基因的24個外顯子上檢測出7個SNPs位點，且均無文獻記載;通過預測堿基突變前后的mRNA及翻譯蛋白結構，發現其中4個錯義突變有可能改變STAT3基因表達，而對江口蘿卜豬的生長發育造成影響。該結論有助于深入研究STAT3基因在豬生產性能開發上的作用，為江口蘿卜豬的分子育種打下基礎。

4 結論

從江口蘿卜豬STAT3基因的24個外顯子上檢測出7個SNPs位點，其中Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4個為錯義突變，除了造成編碼氨基酸改變外，還導致mRNA及編碼蛋白二、三級結構的改變，進而可能對STAT3蛋白的功能造成影響。

參考文獻：

郭奕瑞. 2014. STAT3基因多態性與河南漢族人群肥胖易感性的關系[D]. 鄭州：鄭州大學. [Guo Y R. 2014. Association of polymorphism of STAT3 gene with the susceptibility of obesity in Henan Han population[D]. Zhengzhou：Zhengzhou University.]

馬佩云. 2010. JAK2/STAT3通路對小鼠骨骼肌發育、能量代謝及肌間脂肪相關基因表達的影響[D]. 楊凌：西北農林科技大學. [Ma P Y. 2010. The effect of JAK/STAT3 signal pathway on the expression of skeletal muscle deve-lopment and energy metabolic related genes in mice[D]. Yangling：Northwest A & F University.]

馬祖亮. 2014. 中國漢族人群STAT3基因多態性與肥胖及脂類代謝紊亂的關聯研究[D]. 廣州：南方醫科大學. [Ma Z L. 2014. Association of polymorphisms of STAT3 with obesity and lipid metabolic disorders in Chinese Han population[D]. Guangzhou：Southern Medical University.]

毛同輝，吳高奇，郭義軍. 2015. 江口蘿卜豬種質資源研究進展與開發利用[J]. 中國豬業，（6）：74-76. [Mao T H，Wu G Q，Guo Y J. 2015. Research progress and exploitation of Jiangkouluobo pig germplasm resources[J]. China Swine Industry，（6）：74-76.]

宋舟，張立艷，董海兵，白換力，陳偉，吳帥成，伊鵬霏，付本懂，申海清，韋旭斌. 2012. JAK-STAT信號通路研究進展[J]. 中國畜牧獸醫，39（6）：128-132. [Song Z，Zhang L Y，Dong H B，Bai H L，Chen W，Wu S C，Yi P F，Fu B D，Shen H Q，Wei X B. 2012. Advances in JAK-STAT signaling pathway[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，39（6）：128-132.]

燕志宏，吳高奇，毛同輝，馮文豪，雷荷仙，龍真權，孟華，張廷剛，樊榮. 2010. 江口蘿卜豬種質特性的研究[J]. 貴州農業科學，38（12）：176-178. [Yan Z H，Wu G Q，Mao T H，Feng W H，Lei H X，Long Z Q，Meng H，Zhang T G，Fan R. 2010. Study on germplasm characteristics of Jiangkouluobo pig[J]. Guizhou Agricultural Sciences，38（12）：176-178.]

楊永強，焦仁剛，龔俞，謝海強，惠嫣婷，張依裕，肖超能，劉若余. 2013. 務川黑牛STAT3基因啟動子區SNPs與生長相關性狀的關聯分析[J]. 畜牧獸醫學報，44（8）：1205-1212. [Yang Y Q，Jiao R G，Gong Y，Xie H Q，Hui Y T，Zhang Y Y，Xiao C N，Liu R Y. 2013. Associations of polymorphisms of promoter region of STAT3 gene with growth traits in Wuchuan black cattle[J]. Acta Veterinaria et Zoothenica Sinica，44（8）：1205-1212.]

于月，尤佳， 楊柳，劉勇. 2013. 瘦素信號轉導通路在能量代謝平衡中的作用機制[J]. 生命科學，25（2）：169-175. [Yu Y，You J，Yang L，Liu Y. 2013. Leptin receptor signaling in energy homeostasis[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences，25（2）：169-175.]

Buettner R，Mora L B，Jove R. 2002. Activated STAT signa-ling in human tumors provides novel molecular targets for therapeutic intervention[J]. Clinical Cancer Research，8（4）：945-954.

Chung S S，Wu Y，Okobi Q，Adekoya D，Atefi M，Clarke O，Dutta P，Vadgama J V. 2017. Proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α increased telomerase activity through NF-κB/STAT1/STAT3 activation，and withaferin a inhibi-ted the signaling in colorectal cancer cells[J]. Mediators of Inflammation，2017：5958429. doi：10.1155/2017/5958429.

Clifford L，Ward A C. 2013. Evolution of the JAK-STAT pathway[J]. JAK-STAT，2（1）：e22756.

Herrington J，Smit L S，Schwartz J，Carter-Su C. 2000. The role of STAT proteins in growth hormone signaling[J]. Oncogene，19（21）：2585-2597.

Hirano T，Ishihara K，Hibi M. 2000. Roles of STAT3 in media-ting the cell growth，differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors[J]. Oncogene，19（21）：2548-2556.

Isozaki T，Kasama T，Takahashi R，Odai T，Wakabayashi K，Kanemitsu H，Nohtomi K，Takeuchi H T，Matsukura S，Tezuka M. 2008. Synergistic induction of CX3CL1 by TNF alpha and IFN gamma in osteoblasts from rheumatoid arthritis：Involvement of NF-kappa B and STAT-1 signaling pathways[J]. Journal of Inflammation Research，1：19-28.

Kaplan M H. 2013. STAT signaling in inflammation[J]. JAK-STAT，2（1）：e24198.

Khatib H，Huang W，Mikheil D，Schutzkus V，Monson R L. 2009. Effects of signal transducer and activator of transcription（STAT） genes STAT1 and STAT3 genotypic combinations on fertilization and embryonic survival rates in Holstein cattle[J]. Journal of Dairy Science，92（12）：6186-6191.

Lee S，Shen R，Cho H H，Kwon R J，Seo S Y，Lee J W，Lee S K. 2013. STAT3 promotes motor neuron differentiation by collaborating with motor neuron-specific LIM complex[J]. Proceedings of the National Academy of Scien-ces of the United States of America，110（28）：1144511450.

Ohkubo N，Suzuki Y，Aoto M，Yamanouchi J，Hirakawa S，Yasukawa M，Mitsuda N. 2013. Accelerated destruction of erythrocytes in Tie2 promoter-driven STAT3 conditional knockout mice[J]. Life Sciences，93（9-11）：380-387.

Richard A J，Stephens J M. 2011. Emerging roles of JAK-STAT signaling pathways in adipocytes[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism，22（8）：325-332.

Subramaniam A，Shanmugam M K，Perumal E，Li F，Nachiyappan A，Dai X，Swamy S N，Ahn K S，Kumar A P，Tan B K，Hui K M，Sethi G. 2013. Potential role of signal transducer and activator of transcription（STAT）3 signa-ling pathway in inflammation， survival，proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1835（1）：46-60.

Tripathi S K，Chen Z，Larjo A，Kanduri K，Nousiainen K，?ijo T，Rica?o-Ponce I，Hrdlickova B，Tuomela S，Laajala E，Salo V，Kumar V，Wijmenga C，L?hdesm?ki H，Lahesmaa R. 2017. Genome-wide analysis of STAT3-mediated transcription during early human Th17 Cell differentiation[J]. Cell Reports，19（9）：1888-1901.

Wallenius V，Wallenius K，Ahrén B，Rudling M，Carlsten H，Dickson S L，Ohlsson C，Jansson J O. 2002. Interleukin-6-deficient mice develop mature-onset obesity[J]. Nature Medicine，8（1）：75-79.

Wang Y H，Huang M L. 2010. Organogenesis and tumori-genesis：Insight from the JAK/STAT pathway in the Drosophila eye[J]. Developmental Dynamics，239（10）：2522-2533.

Zhao L，Du X，Huang K，Zhang T，Teng Z，Niu W，Wang C，Xia G. 2016. Rac1 modulates the formation of primordial follicles by facilitating STAT3-directed Jagged1，GDF9 and BMP15 transcription in mice[J]. Scientific Reports，6：23972. doi：10.1038/srep23972.

（責任編輯 蘭宗寶）