交聯殼聚糖微球制備及在酪蛋白糖巨肽分離中的應用

徐平　任效東

摘? ?要：酪蛋白糖巨肽主要是κ-酪蛋白通過凝乳酶降解產生的一類含有糖鏈的多肽，90%的酪蛋白糖巨肽都含唾液酸。其具有顯著的生理功能和營養特性，現已廣泛應用于醫用藥品和保健食品中。首先采用反向乳液交聯法制備交聯殼聚糖微球，經過觀察與測定，結果表明，所制備的殼聚糖微球呈黃色細粉狀，具有較好的分散性，表面比較光滑。通過顯微鏡觀察，發現微球大部分呈較好的球形。并且測定交聯殼聚糖微球的溶脹率為196.64%，含水量為49.15%。然后以D90乳清粉為原料，利用所制備的交聯殼聚糖微球吸附分離CGMP，制作出殼聚糖微球吸附分離CGMP的動態吸附過程穿透曲線，結果表明，吸附流出液中蛋白質質量濃度和唾液酸質量濃度的變化趨勢基本相同，并且在收集液體積達到24 mL時，樣品中的蛋白質和唾液酸開始發生穿透，收集液體積達到64 mL時，基本全部穿透。

關鍵詞：酪蛋白糖巨肽;反向乳液交聯法;交聯殼聚糖微球

酪蛋白糖巨肽（Casein Glycomacropeptide，CGMP）是乳中κ-酪蛋白（κ-CN）上的一個多肽片段，一般是由于凝乳酶切斷κ-酪蛋白的Phe（105）-M et（106）部位形成不溶性的副κ-酪蛋白和可溶性的酪蛋白聚肽（CMP）兩部分，由于CMP中還有很多糖鏈基團，因而被稱為糖巨肽。據報道，CGMP具備多種生物活性的特性，包括對細菌和病毒的抑制作用，對胃腸道分泌物的抑制作用，促進雙歧桿菌的增殖等。

殼聚糖（Chitosan）是由大部分氨基葡萄糖和少量的N-乙酰基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接起來的直鏈多糖，多發現于海洋無脊椎動物、昆蟲、真菌、酵母菌中。工業上殼聚糖生產主要是從蝦、蟹的殼或在海洋產業的豐富廢舊產品中得到[1]。殼聚糖及其衍生物是唯一的堿性天然多糖高分子，可加工成膜、微球等，它具有良好的生物降解性和生物相容性以及無毒、無味等優點，在廢水處理，食品、生物制品的分離純化等領域得到廣泛應用[2-4]。交聯殼聚糖的制備方法目前有兩種：一是反相交聯法[5]，二是滴加成球法[5]。本研究主要是進行交聯殼聚糖微球的制備和特性測定及對殼聚糖微球吸附分離酪蛋白糖巨肽動態吸附過程穿透曲線的研究。

1? ? 實驗

1.1? 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥90，80 目，青島利中甲殼質公司）;新西蘭濃縮乳清蛋白粉D90（34%）;唾液酸試劑盒（美國博世生物技術有限公司）;雙縮脲蛋白質定量試劑盒（北京雷根生物有限公司）;冰乙酸、液體石蠟、司班、聚乙二醇 2000、甲醛、環氧氯丙烷、石油醚、丙酮、無水乙醇等國產試劑。

1.2? 儀器與設備

08-2型磁力攪拌器、DK型恒溫水浴鍋、雷磁PHS-3B pH計均為上海科學精密儀器有限公司生產;HD-3紫外檢測儀、BSZ-100電子鐘控自動部分收集器、HL-2恒流泵、XWT-S臺式記錄儀、CXG-1層析柜均為上海嘉鵬科技有限公司生產;ATY124電子分析天平，日本島津株式會社生產;TD4低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司生產;紫外可見分光光度計，日本島津株式會社生產;顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社生產。

1.3? 方法

1.3.1? 交聯殼聚糖微球的制備

準確量取5 mL冰乙酸溶于245 mL去離子水中得到2%（v/v）的乙酸溶液，再稱取10 g殼聚糖邊攪拌邊加入到上述乙酸溶液中，得到質量分數在4%左右的殼聚糖溶液。放于裝有攪拌器及溫度計的三口燒瓶（1 000 mL）中，具塞。然后加入等體積液體石蠟，約250 mL，常溫下攪拌10 min后升溫到50 ℃，接著加乳化劑司班80數滴和致孔劑PEG2000（0.5%）約2.5 g，高速攪拌30 min，直到殼聚糖溶液分散成大小適宜的液滴為止。再加入適量甲醛溶液（2%v/v）約20 mL預交聯，低速攪拌反應30 min。用氫氧化鈉溶液調節pH為10～11，加入2 mL環氧氯丙烷溶液使濃度為0.04 mol/L，在90～100 ℃下低速攪拌交聯3 h。冷卻后得到的交聯殼聚糖微球樹脂轉移到燒杯，先用石油醚洗滌數次，洗凈微球中殘留的液體石蠟等有機溶劑，然后用乙醇和丙酮充分清洗，再在0.5 mol/L鹽酸溶液中攪拌過夜，這樣可以除去未交聯的殼聚糖，最后再用1 mol/L氫氧化鈉溶液進行浸泡，水洗到中性，得到交聯殼聚糖微球200 mL。

1.3.2? 交聯殼聚糖微球的性質測定

（1）交聯殼聚糖微球的形態觀察和粒徑測定。在顯微鏡下觀察殼聚糖微球的整體形貌并拍攝交聯殼聚糖微球圖像，隨機選取20個微球，通過顯微測微計法分別測定粒徑，然后計算出平均粒徑[6]。

（2）交聯殼聚糖微球溶脹率及含水量的測定。用去離子水將微球充分溶脹，再用濾紙吸干表面的水分，測定濕重Ww值，接著在60 ℃下烘干至恒重，然后測定干重Wd值，計算微球的溶脹率及含水量，公式如下：溶脹率=Ww/Wd×100%;含水量=（Ww/Wd-1）×100%。

1.3.3? 蛋白質質量濃度測定

由于酪蛋白糖巨肽不易被考馬斯亮藍染色，因此，考馬斯亮藍染色法并不能適用于研究蛋白質質量濃度的測定，可采用雙縮脲蛋白質質量濃度測定法對其進行檢測，具體方法見試劑盒使用方法說明書。

1.3.4? 唾液酸質量濃度檢測

唾液酸是酪蛋白糖巨肽的指示標志物，本研究采用唾液酸試劑盒法-間苯二酚-鹽酸法測試，具體方法參見試劑盒使用方法說明書。

1.3.5? 殼聚糖微球吸附分離CGMP的動態吸附過程穿透曲線的繪制

準確量取50 mg/mL乳清粉母液100 mL，再用0.02 mol/L的乙酸鈉緩沖液稀釋至質量濃度25 mg/mL，調節pH至4.6后作為樣品。再量取60 mL殼聚糖微球裝柱，用pH為4.6的緩沖液平衡后加樣200 mL，利用部分收集器收集吸附流出液，對蛋白質質量濃度和唾液酸質量濃度進行檢測，并繪制出動態穿透曲線。

2? ? 結果與分析

2.1? 交聯殼聚糖微球的性質測定

2.1.1? 交聯殼聚糖微球的形態觀察和粒徑測定結果

通過反向乳液交聯的方法制備交聯殼聚糖微球，經觀察，所制備的殼聚糖微球呈黃色細粉狀，具有較好的分散性，表面比較光滑。通過顯微鏡觀察發現微球大部分呈較好的球形，所制備的交聯殼聚糖微球粒徑分別為：121.05、73.68、100.00、63.16、100.00、110.53、100.00、105.26、73.68、78.95、100.00、115.79、94.74、105.26、89.47、110.53、89.47、78.95、68.42、121.05 μm，經計算平均粒徑為95.32 μm。

2.1.2? 交聯殼聚糖微球溶脹率及含水量的測定結果

用去離子水將微球充分溶脹，再用濾紙吸干表面的水分，測定濕重Ww=5.27 g，接著在60℃下烘干至恒重，然后測干重Wd=2.68 g，計算樹脂的溶脹率及含水量分別為196.64%和49.15%。

2.2? 殼聚糖微球吸附分離CGMP的動態吸附過程穿透曲線的繪制

按照1.3.3中的實驗方法，測定部分收集器收集的收集液中蛋白質質量濃度和唾液酸質量濃度，并繪制出動態吸附過程穿透曲線，結果如圖1所示。

從圖1的穿透曲線可以看出，吸附流出液中蛋白質質量濃度和唾液酸質量濃度的變化趨勢基本相同。并且在收集液體積達到24 mL左右時，流出液中開始檢出蛋白質和唾液酸，說明此時樣品中的蛋白質和唾液酸開始發生穿透，當收集液體積達到64 mL左右時，流出液中的蛋白質質量濃度和唾液酸質量濃度基本穩定，蛋白質和唾液酸基本全部穿透，說明此時殼聚糖微球對CGMP的吸附已達飽和。

3? ? 結語

本研究首先用反向乳液交聯法制備了交聯殼聚糖微球，對交聯殼聚糖微球的特性進行了觀察和測定。結果表明，所制備的交聯殼聚糖微球大多數呈黃色球形，經測定交聯殼聚糖微球的平均粒徑為95.32 μm;同時測定它的溶脹率和含水量，得到所制備的交聯殼聚糖微球的溶脹率為196.64%，含水量為49.15%。然后研究了殼聚糖微球吸附分離CGMP的動態吸附過程穿透曲線，從曲線可以看出，吸附流出液中蛋白質質量濃度和唾液酸質量濃度的變化趨勢基本相同，并且，收集液體積達到24 mL時，樣品中的蛋白質和唾液酸開始發生穿透，收集液體積達到64 mL時，蛋白質和唾液酸基本全部穿透。

通過最后的分析研究，發現本課題的實驗方法還有很多需要改進的地方。首先，制得的交聯殼聚糖微球的機械強度不高，容易碎裂且性質不夠穩定，所以要進一步研究交聯殼聚糖微球的制備方法，努力得到機械強度和性質穩定的殼聚糖微球。其次，未能研究樣品液的pH、加樣的質量濃度、氯化鈉洗脫液的質量濃度梯度和洗脫速度等對殼聚糖微球吸附分離CGMP的影響。

[參考文獻]

[1]蔣挺大.殼聚糖[M].北京：化學工業出版社，2003.

[2]陳雪梅，肖文勝，劉煦晴.交聯殼聚糖吸附劑的制備及處理含鉻廢水的研究[J].環境科學與技術，2006，29（4）：74.

[3]史亞君.殼聚糖微球對環丙沙星吸附的研究[J].武漢理工大學學報，2005，27（3）：70.

[4]馮長根，白林山.殼聚糖衍生物吸附劑在蛋白質分離純化的應用[J].離子交換與吸附，2003，19（3）：282.

[5]申屠靜靈.殼聚糖為基質的染料親和吸附劑的制備及其在蛋白質純化中的應用研究[D].杭州：浙江大學，2005.

[6]王紹樹.食品微生物實驗[M].天津：天津大學出版社，1996.