DNA測序技術原理、應用與發展

摘 ?要：核酸是生命體的基本遺傳物質，想要探究遺傳的奧秘，需要從基因組出發進行探究，而DNA測序技術就能為這一類研究提供途徑。隨著科學的進步，測序技術從第一代發展至第三代，甚至第四代測序也開始起步。本文簡要綜述了測序技術的發展歷程、應用及其發展趨勢，重點討論了幾種測序技術的原理。

關鍵詞：測序技術;發展歷程;原理;應用與發展

1測序技術的發展歷程

自Watson和Crick提出DNA雙螺旋結構以來，生物學的研究逐漸深入到分子水平，DNA測序技術一步步發展，并且功能愈多、通量愈高，成本也迅速降低。Whitfeld使用化學毒素和同位素通過層析法進行多聚核苷酸測序。Sanger發明了雙脫氧核苷酸末端終止測序法。Maxam和Gilbertt提出了化學降解法。后來，熒光標記技術取代同位素標記技術，產生了自動化測序技術。同時期出現了雜交測序技術。能同時進行合成與測序的454測序技術的出現，標志著的二代測序技術的誕生。新一代的測序技術還包括了Solexa測序技術、SOLiD測序技術、Complete Genomics測序方法和半導體測序技術。緊接著，以單分子測序為主要特點的第三代測序技術出現。2012年出現了納米孔單分子測序技術、電子顯微鏡觀察法等第四代測序技術。

2幾代測序技術的基本原理

2.1第一代測序技術

Sanger發明了雙脫氧核苷酸末端終止測序法，引入雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），使用四種添加了放射性同位素標記的ddNTP，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過放射自顯影可根據判斷片段的大小和排序，確定整個片段的序列。

Maxam和Gilbertt提出化學降解法，使用32P對DNA鏈的5’端進行放射性標記，利用特殊化學方法修飾降解，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離片段后通過放射性自顯影技術判斷被標記的DNA斷裂末端的堿基，達到測序目的。

雜交測序技術使用待測的變性DNA與已知的單鏈核苷酸進行雜交，根據雜交情況進行序列的排列，得到測序結果。

2.2第二代測序技術

二代測序技術通量高，成本也低。Solexa測序技術（illumina測序儀）的核心原理是邊合成邊測序，核心技術是DNA簇和可逆終止化學反應。在構建測序文庫后，在隨機斷裂形成的DNA片段兩端加上已知序列接頭，進行橋式擴增，在含有基片的流通池內能夠形成橋式結構。再經過30輪擴增后，基片上形成單克隆DNA簇。最后加入熒光可逆終止的四種dNTP和改造的DNA合成酶進行合成反應，通過機器檢測熒光信號，測出核苷酸的序列，而dNTP上的熒光基因最終被化學切割、洗去。

454測序技術利用焦磷酸測序法，使用的是乳液PCR擴增單拷貝DNA片段的微球，而微球置于微孔板中于流通池內進行測序。

SOLID技術的核心是連接反應。構建文庫，進行乳液PCR擴增，富集并沉積磁珠。以8堿基單鏈熒光探針混合物為連接的底物，引物與文庫模板的P1接頭序列雜交，四色熒光標記的雙堿基探針與測序引物連接，進行循環連接檢測和切割，達到測序目的。

Complete Genomics測序在構建文庫時由于兩端加了接頭，形成環狀DNA模板，拷貝序列是類似滾環的擴增方式，形成單克隆DNA納米球（DNB），利用錨定序列與探針的鏈接確定熒光信號測序。

半導體測序技術利用高密度半導體芯片檢測dNTP聚合時產生H+的變化，實時進行測序，該法測序的靈敏度較高。

2.3第三代測序技術

堿基經過納米級別的蛋白孔洞會產生跨膜電導率，可作為測序的依據，第三代測序技術就是建立在納米孔基礎上的技術。具有代表性的基于零級波導的SMRT系統測序核心在于觀測DNA聚合。聚合酶催化單個帶有熒光基團的核苷酸連接，在芯片小孔檢測區內激發出熒光信號從而實現測序。

此外，還有tSMS單分子測序技術以及VisiGen測序技術。

2.4第四代測序技術

第四代測序技術的主要思想是直接讀取DNA序列信息，目前有納米孔單分子測序技術和電子顯微鏡觀察法等方法，處于起步階段，尚待研究。

3應用與發展

第一代測序技術問世后，人們開始進行人類DNA序列測定，絕大部分DNA序列都是基于Sanger測序獲得的，而毛細管電泳測序方法促進了人類基因組計劃的完成。

第二代測序技術的發展，極大的加速了基因組測序、宏基因組測序、DNA甲基化測序、轉錄組測序、目標基因組區域再測序、基因的表觀遺傳修飾檢測、微生物檢測等領域的研究工作。其中，二代測序技術在腫瘤檢測方面甚至其他疾病的治療上有巨大的潛力。

第三代測序技術主要用于基因組測序、甲基化研究、突變鑒定（SNP檢測）等方面，為一些變異快的微生物引起的疾病提供治療策略，幫助人們更好地了解生命的發育過程和疾病的發生機制，也為生物學和功能方面的應用開辟新道路。

從測序技術的發展來看，DNA測序技術以生物學為基礎，不斷融入化學、物理、計算機等學科，并且無一例外地以、提高測序通量與讀長、降低測序成本為目標，不斷前進發展。相信不久后千元基因組甚至百元基因組的目標將會實現。屆時，人們在分子水平的研究又會更上一層樓。

參考文獻

[1] ?付春鵬.DNA測序技術概述[J].生物學教學，2017，42（11）：3-5.

[2] ?高勝寒，禹海英，吳雙陽，等.復雜基因組測序技術研究進展[J].遺傳，2018，40（11）：944-963.

[3] ?李麗娟，師書玥，張村宇，等.單細胞轉錄組測序技術原理及其應用[J].中國畜牧雜志，2019，55（2）：15-21.

[4] ?劉振波.DNA測序技術比較[J].生物學通報，2012，47（7）：14-17.

[5] ?柳延虎，王璐，于黎.單分子實時測序技術的原理與應用[J].遺傳，2015，（3）：259-268.

[6] ?烏日拉嘎，徐海燕，馮淑貞，等.測序技術的研究進展及三代測序的應用[J].中國乳品工業，2016，44（4）：33-37.

[7] ?徐疏梅.新一代DNA測序技術的應用與研究進展[J].徐州工程學院學報（自然科學版），2018，33（4）：60-64.

作者簡介：李瑜，華南師范大學生命科學學院，510000，1998.08，女，漢族，廣東省興寧市，本科在讀。