百里香醌對脂多糖誘導大鼠心肌纖維化的保護作用及機制研究

蔡偉 楊佳丹 高珊 李世琴 王述蓉

中圖分類號 R962；R285；R542.2+3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0464-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.07

摘 要 目的：探討百里香醌（TQ）對脂多糖（LPS）誘導的大鼠心肌纖維化（MF）的保護作用及其可能機制。方法：將40只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組和TQ低、高劑量組[5、10 mg/（kg·d）]，每組10只。除對照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水外，其余各組大鼠均腹腔注射LPS復制MF模型，每天1次，連續3周。自造模第1天起，各給藥組大鼠均腹腔注射相應藥物，每天1次，連續3周。末次給藥后，采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測各組大鼠血清炎癥因子[白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）]含量；稱定并計算其心臟質量參數[心臟質量指數（HW/BM）、左心室質量指數（LVW/BW）]；采用蘇木精-伊紅染色法觀察其心肌組織病理學變化；采用化學分析法、黃嘌呤氧化酶法或酶聯免疫吸附法檢測其心肌組織中氧化應激指標[丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）]和心肌膠原指標[羥脯氨酸（HYP）、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）、Col-Ⅲ]含量或活性；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測其MF相關調控基因[Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、基質金屬蛋白酶3（MMP-3）、MMP-9、轉化生長因子β1（TGF-β1）、Smad3]的mRNA表達情況。結果：與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞腫脹，細胞核大小不一且排列紊亂，纖維增生明顯；血清炎癥因子含量，LVW/BW，心肌組織MDA、HYP、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量以及Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、Smad3的mRNA相對表達量均顯著升高（P<0.05），SOD活性顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，TQ各劑量組大鼠MF程度均有不同程度的改善；TQ低劑量組大鼠血清IL-1β含量，心肌組織MDA、HYP、Col-Ⅰ含量，TQ高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量，LVW/BW，心肌組織MDA、HYP、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量以及TQ各劑量組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1的mRNA相對表達量均顯著降低（P<0.05）；TQ各劑量組心肌組織SOD活性顯著升高（P<0.05）。其余指標組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：TQ對MF模型大鼠具有一定的保護作用，其作用機制可能與抑制炎癥反應和氧化應激反應，下調Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1的mRNA表達有關。

關鍵詞 百里香醌；脂多糖；心肌纖維化；炎癥反應；氧化應激；調控基因；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the protective effect and its mechanism of thymoquinone （TQ） on myocardial fibrosis （MF） induced by lipopolysaccharide in rats. METHODS： Totally 40 male Wistar rats were randomly divided into control group， model group， TQ low-dose and high-dose groups [5， 10 mg/（kg?d）]， with 10 rats in each group. Except that control group was given constant volume of normal saline intraperitoneally， other groups were given LPS intraperitoneally to induce MF model， once a day， for consecutive 3 weeks. Since the first day of modeling， administration group was given relevant medicine intraperitoneally， once a day， for consecutive 3 weeks. After last medication， ELISA method was used to detect the contents of serum inflammation factors （IL-1β， IL-6， TNF-α） in rats. Cardiac mass parameters （HW/BM， LVW/BW） were weighed and calculated. HE staining was used to observe the histopathological changes of myocardial tissue. The contents or activities of oxidative stress indicators （MDA， SOD） and myocardial collagen indexes （HYP， Col-Ⅰ， Col-Ⅲ） were detected by chemical analysis， xanthine oxidase method or ELISA. mRNA expression of regulation genes （Col-Ⅰ， Col-Ⅲ， MMP-3， MMP-9， TGF-β1 and Smad3） related to myocardial fibrosis were determined by real-time fluorescence quantitative PCR. RESULTS： Compared with control group， there were swollen myocardial cells， disordered nuclei of different sizes and visible fiber hyperplasia in model group； the levels of serum inflammatory factors and LVW/BW， cardiac contents of MDA， HYP， Col-Ⅰand Col-Ⅲ， mRNA expression of Col-Ⅲ， TGF-β1 and Smad3 in model group were increased significantly （P<0.05）， while SOD activity was decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the degree of myocardial fibrosis was improved in TQ groups to different extents； serum content of IL-1β and the contents of MDA， HYP and Col-Ⅰ in cardiac tissue in TQ low-dose group， serum contents of IL-1β， IL-6 and TNF-α， LVW/BW and the contents of MDA， HYP， Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in cardiac tissue of TQ high-dose group as well as mRNA expression of Col-Ⅰ， Col -Ⅲ， TGF-β1 in TQ groups were decreased significantly （P<0.05）. The activities of SOD in cardiac tissue were increased significantly in TQ groups （P<0.05）. There was no statistical significance in other indexes among groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： TQ can protect against MF model rats to certain extent， the mechanism of which may be associated with the inhibition of inflammation reaction and oxidant stress reaction， and down-regulation of mRNA expression of Col-Ⅰ， Col-Ⅲ and TGF-β1.

KEYWORDS Thymoquinone； Lipopolysaccharide； Myocardial fibrosis； Inflammatory reaction； Oxidative stress； Regulation genes； Rat

心肌纖維化（MF）是高血壓、病毒性心肌炎、糖尿病心肌病、心力衰竭等眾多心血管疾病發展至終末期的病理表現，可導致患者心肌僵硬度增加、心室舒張功能減退，并引發心律失常，甚至導致猝死，是影響心血管疾病患者預后極為重要的因素之一[1-2]。MF的形成與轉化生長因子β（TGF-β）的產生和分泌、基質金屬蛋白酶（MMP）及金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）的失衡、腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）以及炎癥反應、氧化應激反應的調控等諸多機制關系密切，其中炎癥反應和氧化應激反應在MF的形成過程中發揮著極其重要的作用[3-4]。此外，高脂膳食、吸煙、消耗性疾病、2型糖尿病等均可誘發代謝性內毒素血癥[5]，而體循環中低劑量內毒素或脂多糖（LPS）的慢性刺激又可進一步誘發炎癥反應和氧化應激反應，造成心肌膠原纖維的過量積聚，最終導致MF的發生[6]。

黑種草（Nigella glandulifera Freyn）為毛茛科多年生草本植物。黑種草籽油是采用冷壓萃取法從該植物中提取的油類物質，可用于烹飪、醫療和美容，百里香醌（Thymoquinone，TQ）是其中的主要活性成分。近年來研究發現，TQ具有抗炎和抑制氧化應激反應的藥理活性，可降低實驗動物體內白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽的含量或活性[7-8]，具有抗纖維化的藥理基礎。鑒于此，本研究通過LPS誘導復制大鼠MF模型，初步探討TQ對模型大鼠的保護作用及可能機制，以期為闡明其抗MF的藥理作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BH-2型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；U-2000型紫外-可見分光光度計（日本Hitachi公司）；BS223S型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；CFX ConnectTM型實時定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；SpectraMaxM3型酶標儀（美國MDS公司）；Centrifuge 5427R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

TQ原料藥（批號：117M3245F，純度：>98%）、LPS（批號：113M4068V）均購自美國Sigma Aldrich公司；IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（美國eBioscience公司，批號分別為76851243、76645023、76756032）；羥脯氨酸（HYP）、SOD、MDA檢測試劑盒，蘇木精-伊紅（HE）染色液、Trizol總RNA抽提試劑（南京建成生物工程研究所，批號分別為20170219、20170105、20170213、20170806、20170103）；大鼠Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）、Col-Ⅲ ELISA檢測試劑盒（上海恪敏生物科技有限公司，批號分別為20170223、20170125）；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒（含SYBR green Ⅰ、PCR Buffer、無RNase水等試劑，日本TOYOBO公司，批號：QPK-201T）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

清潔級雄性Wistar大鼠40只，4～8月齡，體質量250～300 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供[生產許可證號：SCXK（川）2015-030]。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

將40只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照組、模型組[LPS 1 mg/（kg·d）]和TQ低、高劑量組[LPS 1 mg/（kg·d）+TQ 5、10 mg/（kg·d），TQ劑量設置參考文獻[9]和本課題組前期預試驗結果]，每組10只。除對照組大鼠腹腔注射與模型組等體積的生理鹽水外，其余各組大鼠均腹腔注射LPS[1 mg/（kg·d）]復制MF模型，每天1次，連續3周[10]。自造模第1天起，各給藥組大鼠均腹腔注射相應藥物（以生理鹽水為溶劑），每天1次，連續3周。

2.2 血清炎癥因子的檢測

末次給藥后，所有大鼠均禁食24 h，用10%水合氯醛（0.3 mL/kg）進行麻醉，于右心室取血5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離上層血清于EP管中，置于4 ℃冰箱保存。采用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，嚴格按照相關試劑盒說明書操作。

2.3 心臟質量參數的檢測

取血后，稱定所有大鼠的體質量（BW，g）；隨后將其處死，開胸取出心臟，除去大血管、心外膜等組織，用生理鹽水清洗、濾紙吸干后，稱定其全心質量（HW，mg）和左心室質量（LVW，mg），并計算心臟質量指數（HW/BW，mg/g）和左心室質量指數（LVW/BW，mg/g）。

2.4 心肌組織的病理學觀察

隨機選取“2.3”項下各組大鼠3只的心臟置于4%多聚甲醛中，固定24 h；常規石蠟包埋、切片（約4～6 μm）、脫蠟、脫水，行常規HE染色。以中性樹膠封片后，置于光學顯微鏡下觀察，每張切片（×200）隨機取10個視野進行觀察并拍照（經染色后，細胞核呈藍色，細胞漿及其他組織呈粉色）。

2.5 心肌組織中氧化應激和心肌膠原指標的檢測

取各組大鼠心臟，以生理鹽水清洗、濾紙吸干，取左心室近心尖1/2處心肌下部組織適量，研磨成組織勻漿，檢測大鼠心肌組織中氧化應激指標（MDA、SOD）和心肌膠原指標（HYP、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ）的含量或活性：采用化學分析法以紫外-可見分光光度計檢測心肌組織中HYP、MDA含量，采用黃嘌呤氧化酶法以紫外-可見分光光度計檢測SOD活性，采用ELISA法以酶標儀檢測Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量，嚴格按照相關試劑盒說明書操作。

2.6 心肌組織中MF相關調控基因mRNA表達的檢測

取“2.5”項下心肌下部組織適量，采用Trizol一步法提取大鼠心肌組織總RNA，使用紫外-分光光度計測定其純度。將總RNA反轉錄為cDNA，使用Primer 5.0軟件設計Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、MMP-3、MMP-9、TGF-β1、Smad3、β-actin的PCR引物（其序列見表1），使用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒、采用實時熒光定量PCR法以實時定量PCR儀進行擴增。反應體系（共50 μL）：cDNA 1 μL，上、下游引物對（25 μmol/L）各0.6 μL，2×PCR Buffer 25 μL，20×SYBR green Ⅰ 0.3 μL，無RNase水22.5 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環35次。以β-actin為內參，生成各目的mRNA的標準曲線、擴增曲線及熔解曲線，采用相對比值法以CFX ManagerTM V2.1軟件計算各目的mRNA的相對表達量（即目的mRNA的Ct值與內參mRNA的Ct值的比值，Ct值表示每個反應管內熒光信號強度達到設定閾值時所經歷的循環數）。

2.7 統計學方法

采用SPSS 15.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，采用雙因素方差分析或Dunnett-t檢驗。檢驗水準α為0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 TQ對MF模型大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，TQ低劑量組大鼠血清IL-1β含量以及TQ高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；而TQ低劑量組大鼠血清IL-6、TNF-α含量差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.2 TQ對MF模型大鼠心臟質量參數的影響

與對照組比較，模型組大鼠LVW/BW顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）；其余指標差異均無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，TQ高劑量組大鼠LVW/BW顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；其余指標差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表3。

3.3 TQ對MF模型大鼠心肌組織病理變化的影響

對照組大鼠心肌組織細胞排列整齊，橫紋清晰，細胞核大小一致；模型組大鼠心肌細胞腫脹，細胞核大小不一，且排列紊亂，可見明顯的纖維增生。與模型組比較，TQ各劑量組大鼠心肌細胞上述癥狀均呈不同程度的改善，且TQ高劑量組較TQ低劑量改善更明顯，詳見圖1。

3.4 TQ對MF模型大鼠心肌組織中氧化應激指標的影響

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，TQ各劑量組大鼠心肌組織中MDA含量均顯著降低，SOD活性均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05），詳見表4。

3.5 TQ對MF模型大鼠心肌組織中心肌膠原指標的影響

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中HYP、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，TQ低劑量組大鼠心肌組織中HYP、Col-Ⅰ含量以及TQ高劑量組大鼠心肌組織中HYP、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；而TQ低劑量組大鼠心肌組織中Col-Ⅲ含量差異無統計學意義（P>0.05），詳見表4。

3.6 TQ對MF模型大鼠MF相關調控基因mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、Smad3的mRNA相對表達量均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余基因的mRNA相對表達量均無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，TQ各給藥組大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1的mRNA相對表達量均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余基因的mRNA相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表5。

4 討論

TQ作為一種天然活性成分，除具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化作用外，還具有抑制肝纖維化[11]、腎纖維化[9]和肺纖維化[12]的藥理作用，具有一定的抗纖維化藥理基礎，但對于其是否能夠有效抑制MF的形成及其可能機制，目前尚鮮有報道。MF是影響心血管疾病患者預后的重要因素，加之臨床尚缺乏理想的治療手段，故抗MF新藥的研發具有重要的臨床意義[1-2]。為此，本研究初步探討了TQ對MF模型大鼠的保護作用及其可能機制。

MF動物模型的復制方法包括壓力超負荷誘導、免疫損傷誘導、缺血誘導、炎癥誘導等，其中LPS誘導較為常用。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種成分，可與宿主細胞細胞膜上的Toll樣受體（TLRs）結合，隨后依次與接頭蛋白（MyD88）、白細胞介素1受體相關激酶（IRAKs）結合，啟動與天然免疫和炎癥反應相關的基因轉錄，誘導機體免疫應答的發生，并促進多種細胞因子和生長因子的釋放，導致心肌組織結構紊亂并最終進展為MF[5，13]。前期研究表明，TQ具有抗炎效應，能夠降低實驗動物體內IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平[7-8]，故本研究參考文獻[10]方法，選用LPS誘導復制MF大鼠模型，用以探討TQ對其相關指標的影響。

IL-1β、IL-6、TNF-α是炎癥反應中重要的炎癥因子，在MF發生發展的過程中具有促進作用。其中，IL-1β可上調多種MMP蛋白的表達水平，并提高纖連蛋白的表達水平；IL-6可激活細胞內JAK/STAT、Ras/Raf等信號通路，使心肌成纖維細胞膠原合成顯著增加，并誘導心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化；TNF-α可能參與了心肌細胞的壞死和凋亡過程，并限制TIMP的表達[14]。本研究采用ELISA法檢測各組大鼠血清炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的含量。結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠上述炎癥因子含量均顯著升高，差異均有統計學意義。這提示LPS可增加大鼠血清炎癥因子的表達，MF模型復制成功。與模型組比較，TQ低劑量組大鼠血清IL-1β含量以及TQ高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低。這表明低、高劑量TQ可不同程度地降低MF模型大鼠血清中炎癥因子的表達，與Alkharfy KM等[15]的研究結果基本一致，提示TQ抗MF作用可能與其抗炎作用有關。

心肌膠原過度沉積是MF形成的關鍵因素及病理基礎。在正常生理條件下，心肌膠原適度表達，可有助于維持心臟的幾何構型，并保證心肌舒縮的協調性；然而在致病條件下，心肌膠原的過度沉積可增加心室壁的僵硬度，降低其順應性，最終導致MF的發生[2]。同時，氧化應激可通過多種信號通路導致心肌細胞壞死、凋亡，促進血管內皮功能紊亂，從而加速MF的形成與發展[4，16]。由此可見，氧化應激和心肌膠原相關因子（如MDA、SOD、HYP、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ）參與了MF的發生與發展過程。其中，氧化應激是由活性分子（如活性氧簇）的生成增加或清除減少而抗氧化酶（如SOD）活性減弱所致；同時，作為脂質過氧化物產物的MDA亦可間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[16]。HYP是膠原組織的主要成分之一，是膠原中特有的氨基酸成分，約占膠原氨基酸總量的13%，其表達水平可間接反映心肌膠原的含量[17]。心肌膠原共有5種類型，在心肌組織中以Col-Ⅰ和Col-Ⅲ為主。Col-Ⅰ有較大的抗牽拉性，主要用于保持心室壁的強度；Col-Ⅲ具有較強的伸展性和彈性，與心室肌有效收縮及泵血功能有關[18]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞腫脹，細胞核大小不一且排列紊亂，纖維增生明顯，其LVW/BW以及心肌組織中MDA、HYP、Col-I、Col-Ⅲ含量均顯著升高，SOD活性顯著減弱。這提示LPS可促進大鼠心肌細胞纖維化，并增加其心肌膠原含量，降低其抗氧化能力。與模型組比較，TQ各劑量組大鼠心肌細胞纖維化程度呈現不同程度的改善，TQ高劑量組大鼠LVW/BW、心肌組織Col-Ⅲ含量以及TQ各劑量組大鼠心肌組織MDA、HYP、Col-Ⅰ含量均顯著降低，TQ各劑量組大鼠心肌組織SOD活性均顯著升高。這提示TQ具有一定的抗氧化應激活性，并可減輕MF模型大鼠的MF程度。

除心肌膠原相關因子外，TGF-β1/Smads通路和MMP也是影響MF的重要機制，其中TGF-β1和Smad3是TGF-β1/Smads通路的關鍵因子，MMP-2和MMP-9是MMP的主要代表，TGF-β1、Smad3的上調以及MMPs的下調均有可能促進MF進展[2]。由此可見，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、MMP-3、MMP-9、TGF-β1、Smad3等的mRNA表達與MF有關。本研究通過實時熒光定量PCR法檢測后發現，與對照組比較，模型組大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、Smad3的mRNA相對表達量均顯著升高。這提示上述基因可能參與了MF的發生。與模型組比較，TQ各劑量組大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1的mRNA相對表達量均顯著降低；而模型組大鼠MMP-2、MMP-9的mRNA相對表達量與對照組比較，TQ各劑量組大鼠MMP-2、MMP-9、Smad3的mRNA相對表達量與模型組比較，差異均無統計學意義。這提示TQ抗MF作用可能與下調Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1的mRNA表達有關，上述基因可能是TQ作用靶點之一；而MMP與MF的發生及TQ抗MF作用是否相關尚有待后續研究深入探討。

綜上所述，TQ對MF模型大鼠具有一定的保護作用，其作用機制可能與抑制炎癥反應和氧化應激反應，下調Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1的mRNA表達有關。但MF的發病機制復雜，且各致病因素相互影響、相互依存，故上述結論及具體作用機制仍有待后續研究進一步證實。

參考文獻

[ 1 ] IACOPO F，LORENZO C，CALOGERO E，et al. Review in translational cardiology：microRNAs and myocardial fibrosis in aortic valve stenosis，a deep insight on left ventricular remodeling[J]. J Cardiovasc Echogr，2016，26（4）：109-114.

[ 2 ] HEYMANS S，GONZáLEZ A，PIZARD A，et al. Searching for new mechanisms of myocardial fibrosis with diagnostic and/or therapeutic potential[J]. Eur J Heart Fail，2015，17（8）：764-771.

[ 3 ] BAO JW，SUN B，MA PP，et al. Rosuvastatin inhibits inflammatory response and resists fibrosis after myocardial infarction[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（1）：238-245.

[ 4 ] VILAHUR G，CASANí L1，PE?A E，et al. Silybum mar- ianum provides cardioprotection and limits adverse remo- deling post-myocardial infarction by mitigating oxidative stress and reactive fibrosis[J]. Int J Cardiol，2018. DOI：10.1016/j.ijcard.2018.06.030.

[ 5 ] LEW WY，BAYNA E，MOLLE ED，et al. Recurrent exposure to subclinical lipopolysaccharide increases mortality and induces cardiac fibrosis in mice[J]. PLoS One，2013. DOI：10.1371/journal.pone.0061057.

[ 6 ] LEW WY，BAYNA E，MOLLE ED，et al. Myocardial fibrosis induced by exposure to subclinical lipopolysaccharide is associated with decreased miR-29c and enhanced NOX2 expression in mice[J]. PLoS One，2014. DOI：10.1371/journal.pone.0107556.

[ 7 ] SHATERZADEH-YAZDI H，NOORBAKHSH MF，HAYATI F，et al. Immunomodulatory and anti-inflammatory effects of thymoquinone[J]. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2018，18（1）：52-60.

[ 8 ] CHEN Y，WANG B，ZHAO H. Thymoquinone reduces spinal cord injury by inhibiting inflammatory response，oxidative stress and apoptosis via PPAR-gamma and PI3K/Akt pathways[J]. Exp Ther Med，2018，15（6）：4987-4994.

[ 9 ] BARGI R，ASGHARZADEH F，BEHESHTI F，et al. Thymoquinone protects the rat kidneys against renal fibrosis[J]. Res Pharm Sci，2017，12（6）：479-487.

[10] NOROUZI F，ABARESHI A，ASGHARZADEH F，et al.The effect of Nigella sativa on inflammation-induced myocardial fibrosis in male rats[J]. Res Pharm Sci，2017，12（1）：74-81.

[11] ASGHARZADEH F，BARGI R，BEHESHTI F，et al. Thymoquinone restores liver fibrosis and improves oxidative stress status in a lipopolysaccharide-induced inflammation model in rats[J]. Avicenna J Phytomed，2017，7（6）：502- 510.

[12] POURGHOLAMHOSSEIN F，SHARIFIFAR F，RASOOLI R，et al. Thymoquinone effectively alleviates lung fibrosis induced by paraquat herbicide through down-regulation of pro-fibrotic genes and inhibition of oxidative stress[J]. Environ Toxicol Pharmacol，2016. DOI：10.1016/j.etap.2016.06.019.

[13] CHEN X，TANG Y，GAO M，et al. Prenatal exposure to lipopolysaccharide results in myocardial fibrosis in rat offspring[J]. Int J Mol Sci，2015，16（5）：10986-10996.

[14] KAWARATANI H，MORIYA K，NAMISAKI T，et al.Therapeutic strategies for alcoholic liver disease：focusing on inflammation and fibrosis：review[J]. Int J Mol Med，2017，40（2）：263-270.

[15] ALKHARFY KM，AHMAD A，JAN BL，et al. Thymoquinone reduces mortality and suppresses early acute inflammatory markers of sepsis in a mouse model[J]. Biomed Pharmacother，2018. DOI：10.1016/j.biopha.2018.01.028.

[16] WANG LP，FAN SJ，LI SM，et al. Oxidative stress promotes myocardial fibrosis by upregulating KCa3.1 channel expression in AGT-REN double transgenic hypertensive mice[J]. Pflugers Arch，2017，469（9）：1061-1071.

[17] XIAO T，LUO J，WU Z，et al. Effects of hydrogen sulfide on myocardial fibrosis and PI3K/AKT1-regulated autophagy in diabetic rats[J]. Mol Med Rep，2016，13（2）：1765- 1773.

[18] 吳限，黎明江，李莎.心肌纖維化病理染色鑒定方法的綜合評價[J].醫學研究雜志，2017，46（9）：34-37.

（收稿日期：2018-10-17 修回日期：2018-12-07）

（編輯：張元媛）