中華絨螯蟹羧酸酯酶基因克隆及其在農藥脅迫下的表達變化

臧亞南　張曉　黃鵬丹　KassimuHashimAme　沈懷舜

摘要：【目的】明確中華絨螯蟹羧酸酯酶基因（ES-CXEs）在中華絨螯蟹不同組織及在農藥脅迫下的應激表達模式，為揭示其代謝解毒機制打下理論基礎?！痉椒ā坎捎肦ACE克隆ES-CXEs基因全長序列，并進行生物信息學分析;以實時熒光定量PCR檢測中華絨螯蟹不同組織及在農藥脅迫下ES-CXEs基因的表達變化?！窘Y果】從中華絨螯蟹肝胰腺中克隆獲得兩段ES-CXEs基因cDNA序列（ES-CXE5和ES-CXE6），其中，ES-CXE5基因序列全長1889 bp（GenBank登錄號MH201558），包括132 bp的5'端非編碼區（5'UTR）、122 bp的3'端非編碼區（3'UTR）和1635 bp的開放閱讀框（ORF），推測其編碼544個氨基酸序列;ES-CXE6基因序列全長3089 bp（GenBank登錄號MH201555），包括282 bp的5'UTR、779 bp的3'UTR和2028 bp的ORF，推測其編碼675個氨基酸序列。多序列比對分析結果顯示，ES-CXE5和ES-CXE6基因均具有CXEs家族的特征序列，即催化三聯體結構（S-E-H）和N-糖基化位點。ES-CXE5氨基酸序列與三疣梭子蟹、日本長額蝦等甲殼類CXEs聚為一簇，而ES-CXE6氨基酸序列與水蚤類和蕪菁葉蜂的CXEs聚為一簇。組織特異性表達分布顯示，ES-CXEs基因在雌、雄性中華絨螯蟹不同組織中的相對表達量無顯著差異（P>0.05），且在肝胰腺、肌肉、精巢和副性腺中均有表達，以肝胰腺中的相對表達量最高。在安全濃度的阿維菌素、敵百蟲和高效氯氰菊酯脅迫下，ES-CXEs基因在中華絨螯蟹肝胰腺中的相對表達量呈明顯誘導表達趨勢，且ES-CXE5基因的相對表達量高于ES-CXE6基因?！窘Y論】從中華絨螯蟹肝胰腺中克隆獲得的ES-CXE5和ES-CXE6基因屬于CXEs基因家族，在肝胰腺中高表達，且在農藥脅迫下這兩個基因的表達呈明顯誘導表達趨勢而參與殺蟲劑的代謝解毒過程。

關鍵詞： 中華絨螯蟹;羧酸酯酶（CXEs）;克隆;殺蟲劑;代謝解毒

中圖分類號： S966.16 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-1093-11

Abstract：【Objective】Expression patterns of Eriocheir sinensis carboxylesterase gene（ES-CXEs）in various tissues and under pesticide tress were studied to provide theoretical basis for revealing its metabolic detoxification mechanism. 【Method】The full sequence of the ES-CXEs gene was cloned by using rapid-amplification of cDNA ends（RACE） technolo-gy and bioinformatics analysis was also conducted. Real-time fluorescence quantitative PCR was used for its expression analysis in various tissues and after pesticide treatment. 【Result】Two cDNA full-length sequences of ES-CXEs genes were cloned from E. sinensis hepatopancreas（named ES-CXE5 and ES-CXE6）. Full-length sequence of ES-CXE5 was 1889 bp（GenBank accession number：MH201558）， consisting of a 5'-untranslated region（UTR） of 132 bp， a 3'-UTR of 122 bp and an open reading frame（ORF） of 1635 bp. The deduced protein had 544 amino acids sequences. Full-length sequence of ES-CXE6 was 3089 bp（GenBank accession number：MH201555）， consisting of a 5'-UTR of 282 bp， a 3'-UTR of 779 bp and an ORF of 2028 bp. The deduced protein had 675 amino acids sequences. Multiple alignments revealed that both ES-CXE5 andES-CXE6 contained typical sequence of the CXEs family， which was catalytic triad structure and N-glycosylation site. Amino acid sequence of ES-CXE5 were clustered with Portunus trituberculatus，Pandalopsis japonica and other crustaceans. Amino acid sequence of ES-CXE6 were clustered with Daphnia magna and Athalia rosae. Tissue speci-fic-expression analysis showed that the relative expression level of two ES-CXEs genes were not significantly different in different tissue of female and male E. sinensis（P>0.05） and they were expressed in gill， hepatopancreas， muscle， testis and accessory gonads， with the highest relative expression in hepatopancreas. The expression levels of the two ES-CXEs genes in the hepatopancreas of E. sinensis exposed to low doses of avermectin，trichlorfon and β-cypermethrin were greatly induced， and the relative expression of ES-CXE5 were higher than that of ES-CXE6. 【Conclusion】ES-CXE5 and ES-CXE6 genes， cloning from the hepatopancreas of E. sinensis，belong to CXEs family，highly express in hepatopancreas， and their expression levels under pesticide stress are induced，thus they involve in the detoxification of the pesticides.

Key words： Eriocheir sinensis; carboxylesterases（CXEs）; cloning; pesticide; metabolic detoxification

0 引言

【研究意義】中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，隸屬于節肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacen）十足目（Decapoda），是我國水產養殖最重要的甲殼物種之一（Shen et al.，2014）。近年來，中華絨螯蟹市場需求量日益增加，養殖密度及規模不斷擴大，加之殺蟲劑和除藻劑的普遍使用，導致其養殖環境越來越惡劣，各種病害頻發（耿雪冰，2010）。同時，在農業生產中常使用農藥防控農作物害蟲，部分農藥通過地表徑流、雨水沖刷、生活廢水等途徑進入水體環境，或造成養殖水源污染（徐春娟等，2017;韓松等，2018），進而引起甲殼類動物暴發各種病害。羧酸酯酶（Carboxylesterases，CXEs）作為一種多功能家族酶系，能代謝多種藥物、環境毒物及致癌物，有效防止病原菌的致病作用（滕霞和孫曼霽，2003;張敏文等，2012），但關于其在甲殼類中的代謝解毒研究較少，因此，克隆CXEs基因并明確其分子生物學特性，可為進一步研究中華絨螯蟹CXEs代謝解毒機制打下理論基礎?！厩叭搜芯窟M展】CXEs又稱脂族酯酶，在動物、植物和微生物體內均有存在，具有催化三聯體結構和近N端的糖基化位點，能維持酶活性和活性位點的穩定（Bornscheuer，2002）。CXEs作為昆蟲體內三大解毒酶系之一，其抗藥機理已得到廣泛研究，如酯酶E4結構基因擴增假說（Devonshire and Sawicki，1979）、酯酶A1基因擴增理論（Georghiou and Saito，1983）和最早在銅綠蠅（Lucilia cuprina）中發現G317D突變使其對有機磷農藥產生抗性（Newcomb et al.，1997）。目前的研究表明，昆蟲對有機磷、氨基甲酸酯和溴氰菊酯類農藥產生抗藥性與其體內CXEs解毒代謝活性的增強有關，而CXEs代謝活性的增強主要是通過昆蟲CXEs基因擴增、基因表達調控及基因突變來實現（Small and Hemingway，2000;Li et al.，2007）。Cui等（2007）通過定點誘變，從尖音庫蚊（Culex pipiens）突變體中篩選出一個能提高馬拉硫磷代謝活力的突變體;Pou-pardin等（2014）對埃及伊蚊（Aedes aegypti）的研究發現，基因擴增是CCEae3a在抗性品系中上調表達的主要方式;王芮等（2017）在灰飛虱（Laodelphax striatellus）抗毒死蜱品系、抗吡蟲啉品系和抗溴氰菊酯品系中篩選導致總酯酶活力升高的酯酶基因，結果發現灰飛虱CXEs基因過量表達與灰飛虱對毒死蜱和吡蟲啉的抗性相關。有關甲殼類CXEs活性的研究，來有鵬等（2008）研究認為，CXEs可作為一種生物標志物，通過測定其活性可反映農藥對河蝦的安全性;Solé和Sanchez-Hernandez（2015）通過體外酶試驗探討水生生物CXEs活性對14種藥物和個人護理用品（PPCPs）的敏感性，結果表明，100 μmol/L脂類調節劑Simvastatin和Fenofibrate能有效抑制所有靶種的CXEs活性;Shen等（2017）研究證實，當中華絨螯蟹患有肝胰腺壞死病（HPND）時，其體內CXEs基因表達水平較健康蟹呈顯著上調趨勢;Zhu等（2018）研究表明，當羅氏沼蝦受嗜水氣單胞菌和副溶血性弧菌侵染時，其肝胰腺中CXEs基因mRNA水平顯著升高?！颈狙芯壳腥朦c】基于CXEs基因的昆蟲農藥代謝解毒研究已有較多報道，但有關中華絨螯蟹CXEs基因（ES-CXEs）的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】在克隆ES-CXEs基因全長序列的基礎上進行生物信息學分析，并探討該基因在中華絨螯蟹不同組織及在農藥脅迫下的應激表達模式，為揭示其代謝解毒機制打下理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

中華絨螯蟹取自江蘇省鹽城市某養殖場，在玻璃缸內（97 cm×48 cm×63 cm）暫養，并使用泵氧系統模擬自然生長環境，水溫保持在（20.0±1.0）℃，分早晚兩次投喂飼料。在試驗開始前先暫養1周以適應養殖缸環境。挑選有活力的成熟中華絨螯蟹，雌、雄性各3只，解剖后用液氮速凍其心臟、鰓、肝胰腺、肌肉、腸道、精巢、卵巢和副性腺等組織， -80 ℃保存備用。TRIzol Reagent、HiFiScript cDNA Synthesis Kit和ULtraSYBR Mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司;SMARTer? RACE 5' Kit User Manual and 3'-Full RACE Core Set v.2.0、Gel Extraction Kit、pMD19-T載體和大腸桿菌DH5α感受態細胞購自TaKaRa公司;氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC水、NaCl、瓊脂、氨芐青霉素和San Prep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設備：低溫離心機（湘儀TGL-16M高速臺式冷凍離心機）、凝膠成像系統（Beckman Coulter CEQ 8000）、PCR儀（Eppendorf Autheri-zed Thermal Cycler）、熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，New York，USA）和搖床（華利達 HZ-9511K恒溫振蕩器）。

1. 2 農藥脅迫

隨機挑取中華絨螯蟹（5.5±0.5 g/只）分成4組，每組3個平行，放養于玻璃缸內，各組分別添加0.002 μL/L阿維菌素、0.0050 g/L敵百蟲和0.001 μL/L高效氯氰菊酯（表1），并設空白對照。以蒸餾水將3種殺蟲劑（表1）稀釋到半致死濃度試驗得到的安全濃度，其中，阿維菌素安全濃度4.08×10-4μg/L，高效氯氰菊酯安全濃度8.52×10-5 μg/L，敵百蟲安全濃度5.00×10-4 g/L。然后分別在添加殺蟲劑后0、3、6、12、24和48 h從各玻璃缸中隨機挑出3只中華絨螯蟹，解剖后用液氮速凍其肝胰腺組織，-80 ℃保存備用。

1. 3 總RNA提取

取0.1 g中華絨螯蟹肝胰腺組織置于液氮中充分研磨，參照TRIzol Reagent操作說明進行總RNA提取，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性及微量紫外分光光度計檢測其純度后，-80 ℃保存備用。

1. 4 ES-CXEs基因克隆

根據轉錄組獲取的部分CXEs基因保守序列（Shen et al.，2017），設計擴增ES-CXE5和ES-CXE6序列的引物（表2），并委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。參照SMARTer? RACE 5' Kit User Manual and 3'-Full RACE操作說明將中華絨螯蟹肝胰腺總RNA反轉錄成cDNA第一鏈，以3'-RACE cDNA和5'-RACE cDNA為模板、3'GSP和5'GSP為引物，分別進行3'端和5'端序列的快速擴增。

PCR反應體系20.0 μl：3'-RACE（5'-RACE）cDNA模板1.0 μL，10 μmol/L 3'GSP（5'GSP）引物0.4 μL，10 mmol/L dUPM通用引物2.0 μL，SeqAmp DNA聚合酶0.4 μL，2×SeqAmp Buffer 10.0 μL，PCR-Grade H2O 6.2 μL。擴增程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，進行5個循環;94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，進行5個循環;94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，進行25個循環。RACE-PCR產物經DNA膠回收后，將其連接至pMD19-T載體，37 ℃連接4 h，然后轉化DH5α感受態細胞，培養箱37 ℃恒溫培養12 h。從藍白斑菌落中挑選白斑，并接種至LBA液體培養基中繼續振蕩培養至菌液渾濁（約6 h），經PCR鑒定篩選后，陽性菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序及拼接。

1. 5 生物信息學分析

測序結果利用NCBI VecsCXEen（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecsCXEen/）進行分析后去除載體，使用DNAMAN v.5.2.2將各片段進行拼接，以獲得cDNA全長序列;利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析其開放閱讀框;采用Net NGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預測N-糖基化位點;利用NCBI進行兩序列的蛋白相似性分析，并以DNAMAN v.5.2.2進行序列翻譯;使用Compute pI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計算其相對分子量和理論等電點（pI）;運用DNAMAN v.5.2.2及多序列對比工具（http：//www.biosoft.net/sms/）進行氨基酸多序列比對;并以MEGA 7.0的最大似然法（Maximum likelihood，ML）構建系統發育進化樹。

1. 6 實時熒光定量PCR檢測

采集中華絨螯蟹不同組織及3種殺蟲劑處理后6個時間點的肝胰腺樣品，分別提取總RNA后進行RNase-free DNase處理，以消除基因組DNA的影響。以RNA為模板反轉錄合成cDNA第一鏈，再以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測。依據克隆得到的ES-CXEs基因全長序列設計實時熒光定量PCR擴增引物（表2）。以中華絨螯蟹β-actin基因（GenBank登錄號HM053699）為內參基因，設計引物β-actin-F和β-actin-R，并驗證各內參樣品的表達穩定性，根據Schmittqen和Livak（2008）提出的2???Ct法計算各樣品中ES-CXEs基因相對表達量。每個樣品設3個重復，內參基因設2個重復。實時熒光定量PCR反應體系20.0 μL：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，以ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃ 預變性3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，進行35個循環。利用SPSS 18.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 ES-CXEs基因全長cDNA序列分析結果

以中華絨螯蟹肝胰腺總RNA為模板進行RACE擴增，克隆得到兩段ES-CXEs基因cDNA序列（圖1和圖2）。其中，ES-CXE5基因序列全長1889 bp（GenBank登錄號MH201558），包括132 bp的5'端非編碼區（5'UTR）、122 bp的3'端非編碼區（3'UTR）和1635 bp的開放閱讀框（ORF），推測其編碼544個氨基酸序列，編碼蛋白的相對分子量為60.55 kD，pI為4.54;ES-CXE6基因序列全長3089 bp（GenBank登錄號MH201555），包括282 bp的5'UTR、779 bp的3'UTR和2028 bp的ORF，推測其編碼675個氨基酸序列，編碼蛋白的相對分子量為75.06 kD，pI為4.57。兩個ES-CXEs基因序列末端均有加尾信號poly（A）結構（AATAAA），二者對應的推導氨基酸序列一致性為32%。

2. 2 ES-CXEs氨基酸多序列比對及其系統發育進化樹

氨基酸多序列比對分析結果（圖3）表明，兩段ES-CXEs氨基酸序列（ES-CXE5和ES-CXE6）均具有CXEs家族的特征序列，即催化三聯體結構（S-E-H）、RF和GG結構及N-糖基化位點。聚類分析結果（圖4）也顯示，ES-CXE5氨基酸序列與三疣梭子蟹和日本長額蝦的CXEs聚為一簇，對應的氨基酸序列相似性分別為43%和41%;而ES-CXE6氨基酸序列與水蚤類和蕪菁葉蜂的CXEs聚為一簇，對應的氨基酸序列相似性分別為34%和39%。

2. 3 ES-CXEs基因在中華絨螯蟹不同組織中的表達情況

采用實時熒光定量PCR檢測ES-CXEs基因在中華絨螯蟹心臟、鰓、肝胰腺、肌肉、腸道、卵巢、精巢和副性腺等組織中的表達情況，結果表明，ES-CXEs基因在雌、雄性中華絨螯蟹不同組織中的相對表達量無顯著差異（P>0.05），且在肝胰腺、肌肉、精巢和副性腺中均有表達（圖5）。ES-CXEs基因在中華絨螯蟹肝胰腺中的相對表達量最高，而在心臟、鰓和卵巢中幾乎不表達。

2. 4 農藥脅迫下ES-CXEs基因的表達模式

在未經農藥脅迫的中華絨螯蟹肝胰腺中，ES-CXEs基因（ES-CXE5和ES-CXE6）在6個時間點的相對表達量幾乎沒有變化。在阿維菌素、敵百蟲和高效氯氰菊酯的脅迫下，ES-CXEs基因在中華絨螯蟹肝胰腺中的相對表達量呈明顯波動趨勢（圖6），表現為誘導表達模式。其中，經阿維菌素脅迫24 h后，中華絨螯蟹肝胰腺中的ES-CXE5和ES-CXE6相對表達量最高，約是對照組的53.2和3.2倍;經敵百蟲脅迫6 h后，中華絨螯蟹肝胰腺中的ES-CXE5和ES-CXE6相對表達量最高，約是對照組的29.9和3.0倍;經高效氯氰菊酯脅迫12 h后，中華絨螯蟹肝胰腺中的ES-CXE5和ES-CXE6相對表達量最高，約是對照組的35.6和3.2倍。

3 討論

CXEs作為生物體內重要的初級代謝酶系，對殺蟲劑等內外源物質的代謝、激素降解及神經系統發育起重要作用（Li et al.，2007;Yan et al.，2009;朱曉曄等，2018）。目前，已從昆蟲和甲殼類物種中克隆獲得多個CXEs基因序列（Lee et al.，2011;Tao et al.，2017;Xu et al.，2017;白微微等，2018）。其中，昆蟲類CXEs的代謝解毒、激素降解等功能研究已較深入，但在甲殼類中關于CXEs的功能研究以激素代謝為主（Lee et al.，2011;白微微等，2018）。本研究通過RACE克隆獲得兩段ES-CXEs基因序列（ES-CXE5和ES-CXE6），其氨基酸多序列比對分析結果顯示，ES-CXE5和ES-CXE6氨基酸序列均含有CXEs家族的保守區域——催化三聯體結構（S-E-H），表明二者具有酯酶活性。此外，存在4個不同的N-糖基化位點。N-糖基化位點可維持哺乳動物CXEs的穩定性及其催化效率（Kroetz et al.，1993）。聚類分析結果表明，ES-CXE5氨基酸序列與太平洋白對蝦、三疣梭子蟹等甲殼類的氨基酸序列具有較高相似性，優先聚為一支，再與飛蝗等保幼激素聚為一支;而ES-CXE6氨基酸序列與蕪菁葉蜂和水蚤等的氨基酸序列相似度較高，優先聚為一支，再與α-酯酶和β-酯酶聚為一支。已有研究表明，α-酯酶在異源物質解毒如有機磷殺蟲劑抗性中發揮重要作用，β-酯酶也能介導多種殺蟲劑及其他異源物質的代謝，而保幼激素酯酶可參與殺蟲劑代謝解毒（Ranson et al.，2002;任娜娜等，2014）。由此推測，ES-CXE5和ES-CXE6也與殺蟲劑的代謝解毒有關。

為了解ES-CXEs基因的分子特性，本研究采用實時熒光定量PCR檢測其在中華絨螯蟹雌雄不同組織中的表達情況，結果顯示ES-CXEs基因多組織分布與CXEs在昆蟲及甲殼類多組織部位分布（Lee et al.，2011;任娜娜等，2014;Tao et al.，2017;Xu et al.，2017）的觀點一致。昆蟲脂肪體的主要功能是負責能量儲存和有毒物質代謝及解毒（Arrese and Soulages，2010）。在甲殼類物種中，其肝胰腺與昆蟲的脂肪體相似，也是各類物質新陳代謝的主要部位（Lee et al.，2011;Tao et al.，2017;Xu et al.，2017）。本研究中，ES-CXEs基因在中華絨螯蟹肝胰腺中的相對表達量明顯高于其他組織，進一步驗證該觀點。CXEs基因在日本長額蝦、三疣梭子蟹和中華絨螯蟹的卵巢中也呈高表達（Lee et al.，2011;Tao et al.，2017;Xu et al.，2017），但本研究結果顯示ES-CXE5和ES-CXE6基因在中華絨螯蟹卵巢中幾乎不表達。此外，與ES-CXE6基因相比，ES-CXE5基因的組織表達分布更廣泛，故推測ES-CXE5具有更廣泛的功能。

CXEs介導害蟲抗藥性主要是通過提高對殺蟲劑的水解活性，增強對殺蟲劑的阻隔或改變酶與底物的親和力而發揮作用（Lima et al.，2013;徐春娟等，2017）。CXEs基因表達量的增加會促使其解毒酶活性提高，進而增強昆蟲的抗藥性（黃水金等，2010;楊帥等，2012;Zhang et al.，2014;劉蘇等，2015;來守國等，2018）。在本研究中，經阿維菌素、敵百蟲和高效氯氰菊酯3種農藥脅迫后，ES-CXE5和ES-CXE6基因在中華絨螯蟹肝胰腺中的相對表達量明顯增加，表明這兩個CXEs基因參與了阿維菌素、敵百蟲和高效氯氰菊酯的解毒過程，具有代謝解毒作用。

昆蟲在受外源藥劑脅迫下，其體內相應的防御解毒體系因受刺激而產生效應以降低毒害作用（Chevillon et al.，1999;張建琴等，2014;白薇薇等，2018）。在本研究的空白對照組中，兩個ES-CXEs基因在6個時間點的相對表達量幾乎沒有變化;而在阿維菌素、敵百蟲和高效氯氰菊酯的脅迫下，表現出明顯的誘導表達趨勢，說明阿維菌素、敵百蟲和高效氯氰菊酯對ES-CXEs基因的表達具有一定影響，據此推測低濃度的殺蟲劑可刺激ES-CXEs基因表達，使其參與殺蟲劑的解毒代謝過程。此外， ES-CXE5基因的相對表達量明顯高于ES-CXE6基因，意味著ES-CXE5對殺蟲劑的脅迫更敏感，而在殺蟲劑代謝解毒方面發揮更大的作用。自2015年以來，肝胰腺壞死綜合癥已成為中華絨螯蟹養殖中的主要病害，而環境毒物是引起肝胰腺壞死綜合癥的主要原因之一。Shen等（2017）研究發現，與未患病的中華絨螯蟹相比，患有肝胰腺壞死綜合癥中華絨螯蟹的CXEs家族基因表達量顯著上調。本研究結論進一步驗證中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合癥的發生與其養殖水體中殺蟲劑的污染情況密切相關。

4 結論

從中華絨螯蟹肝胰腺中克隆獲得的ES-CXE5和ES-CXE6基因屬于CXEs基因家族，在肝胰腺中高表達，且在農藥脅迫下這兩個基因的表達量均呈明顯誘導表達趨勢而參與殺蟲劑的代謝解毒過程。

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（責任編輯 蘭宗寶）