黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯對甘蔗尾葉營養價值的影響

周俊華　王啟芝　周志揚　穆勝龍　黃香　羅鮮青　黃麗霞　梁琪妹　孫俊麗　唐承明　何仁春

摘要：【目的】探討黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯對甘蔗尾葉營養價值的影響，為甘蔗尾葉有效利用和青貯飼料研究提供參考依據。【方法】以新鮮甘蔗尾葉為原料，分有氧發酵和無氧青貯兩段進行，試驗設對照組、試驗I組、試驗II組和試驗III組。有氧發酵階段，對照組、試驗I組、試驗II組和試驗III組每千克新鮮甘蔗尾葉分別噴灑100 mL無菌水、10 mL黑曲霉菌液（8.75×107 CFU/mL，下同）+90 mL無菌水、20 mL黑曲霉菌液+80 mL無菌水、30 mL黑曲霉菌液+70 mL無菌水，在無菌室室溫下有氧發酵48 h;厭氧發酵階段，對照組每千克樣品噴灑100 mL無菌水，3個試驗組每千克樣品均噴灑10 mL乳酸芽孢桿菌菌液（1.1×108 CFU/mL）+90 mL無菌水，混勻后罐裝密封，室溫青貯45 d后取樣分析其常規營養成分、康奈爾凈碳水化合物—蛋白質體系（CNCPS）營養指標、蛋白組分及碳水化合物組分。【結果】試驗I組和試驗III組粗蛋白（CP）水平顯著高于對照組（P<0.05，下同）;3個試驗組的木質素（Lignin）含量均顯著低于對照組;淀粉（Starch）含量以試驗III組最高，顯著高于對照組和試驗I組。試驗組CNCPS碳水化合物組分較對照組均有所改善，尤其是試驗III組效果最明顯，試驗III組的總碳水化合物（CHO）、非結構性碳水化合物（NSC）、快速降解碳水化合物（CA）、中速降解碳水化合物（CB1）和緩慢降解碳水化合物（CB2）水平最高，均顯著高于對照組、試驗I組和試驗II組;非蛋白氮（PA）和中速降解蛋白（PB2）在對照組與試驗組間差異顯著，各試驗組的快速降解真蛋白（PB1）和慢速降解真蛋白（PB3）含量高于對照組，不可利用蛋白（PC）顯著低于對照組，黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯可提高甘蔗尾葉CNCPS蛋白品質。【結論】綜合考慮青貯甘蔗尾葉CNCPS碳水化合物組分及蛋白組分，以試驗III組（2.625×106 CFU/g黑曲霉+1.1×106 CFU/g乳酸芽孢桿菌兩段青貯）對改善甘蔗尾葉營養價值效果最佳。

關鍵詞： 黑曲霉;乳酸芽孢桿菌;兩段青貯;CNCPS;甘蔗尾葉

中圖分類號： S816.53 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-1078-07

Abstract：【Objective】The aim was to explore the influence of two-stage silage while adding Aspergillus niger and lactic acid bacillus inoculants on the nutrient values of sugarcane tops silage and provide reference for effective utilization of sugarcane tops and silage research. 【Method】The test took the fresh sugarcane tops as materialand set aerobic fermentation and anaerobic silage. Control group， test ?group I， test groupII ?and test group III were set. At the first stage， for each kilogram fresh weight of sugarcane tops， the control group adding sterile water at dose of 100 mL/kg; Group I adding sterile water at dose of 90 mL and A. niger at dose of 10 mL（8.75×107 CFU/mL， the same below）; Group IIadding sterile water at dose of 80 mL and A. niger at dose of 20 mL; Group III adding sterile water at dose of 70 mL and A. niger at dose of 30 mL， indoor temperature，aerobic fermentation for 48 h. At the second stage， for each kilogram fresh weight of sugarcane tops， the control group adding sterile water at dose of 100 mL. The test groups adding lactic acid bacillus inoculant at dose of 10 mL（1.1×108 CFU/mL） and sterile water at dose of 90 mL to ensile，respectively. The cornell net carbohydrate and protein systems（CNCPS） was used to evaluate nutrient values of sugarcane tops silage after ensiling 45 d in canned sealed silage at indoor temperature. 【Result】Crude protein（CP） of the test group I and test group III was significantly higher than the control group（P<0.05，the same below）. The lignin content of three test groups was significantly lower than the control group. The starch content of the group III was significantly higher than the control group and group I，which was the highest in the four groups. The CNCPS carbohydrate of the test groups could be improved compared with control group， especially group III. Total carbohydrate（CHO）， non-structural carbohydrates（NSC）， rapidly degraded carbohydrate（CA）， intermediately degraded carbohydrate（CB1） and slowly degraded carbohydrate（CB2） of group III were the highest， significantly higher than the control group， test group I and test group II. There was significant diffe-rence in nonprotein nitrogen（PA） and intermediately degraded protein（PB2） between control group and test groups. Rapidly degraded protein（PB1） and slowly degraded protein（PB3） of test groups were higher than control group， but unusable protein（PC） was significantly lower than control group. A. niger and lactic acid bacillus two-stage silage could improve CNCPS protein quality if sugarcane tops. 【Conclution】According to the CNCPS carbohydrate fractionations and protein fractionations in sugarcane tops，the effects of test group III（2.625×106 CFU/g A. niger +1.1×106 CFU/g lactic acid bacillus two-stage silage）on improving sugarcane tops nutrient value is the best.

Key words： Aspergillus niger; lactic acid bacillus; two-stage silage; CNCPS; sugarcane top

0 引言

【研究意義】黑曲霉（Aspergillus niger）是絲狀真菌的一個常見種，廣泛分布于植物產品、糧食及土壤中，是美國FDA認證的安全菌種（GRAS）之一，2013年我國農業部批準允許黑曲霉在飼料中添加使用。黑曲霉生長旺盛、發酵周期短，不產生毒素，在我國古代人們就利用其制作醬料、醬油及米酒等。已有研究報道，黑曲霉是一種真核生物，耐pH范圍為2.5～6.5，可適應溫度26～37 ℃，細胞內具有內含子，高爾基體、內質網等蛋白后加工模塊及復雜的基因排列方式等原核生物沒有的特征，該特征使得黑曲霉可生產纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等多種酶及一些結構較復雜的蛋白質（Kuivanen et al.，2015;張熙和韓雙艷，2016）。乳酸芽孢桿菌（Lactic acid bacillus）是能發酵糖類物質產生乳酸的一類桿菌，具有乳酸桿菌優勢，同時具有芽孢桿菌抵抗不利環境的特性，是目前益生菌研究的熱點之一。甘蔗尾葉是甘蔗收割后的副產品，每年11月—翌年4月是南方甘蔗收割期，也是南方的枯草期，將黑曲霉和乳酸芽孢桿菌添加到甘蔗尾葉中進行有氧發酵及無氧青貯，既能合理利用甘蔗尾葉以緩解反芻動物越冬度春青綠飼料不足的問題，又可將田間廢棄物變廢為寶。【前人研究進展】目前，針對甘蔗尾葉的青貯已有不少研究報道。Pedroso等（2008）、dos Santos等（2015）研究發現，添加布氏乳桿菌可提高青貯甘蔗尾葉的有氧穩定性，降低乙醇含量及酵母菌數量，但對于改善青貯甘蔗尾葉的干物質損失沒有效果。Carvalho等（2012）在甘蔗尾葉青貯過程中添加丙酸及布氏乳桿菌，發現其可提高甘蔗尾葉的青貯品質，抑制梭酸菌等有害菌生長。王定發等（2015）研究發現，在甘蔗尾葉青貯過程中添加纖維素酶或丙酸可提高其飼用價值。Chizzotti等（2015）研究發現，甘蔗尾葉在青貯過程中添加氧化鈣可降解青貯甘蔗尾葉纖維素水平，但氧化鈣添加量不能超過15 g/kg，否則會影響牛的日采食量及生產性能。Daniel等（2015）的研究結果表明，青貯過程中添加開菲爾乳桿菌可減少青貯甘蔗尾葉的營養損失，提高乙酸及1，2-丙二醇水平。Olivcira-Borgatti等（2015）研究表明，在甘蔗尾葉青貯過程中添加氫氧化鈉、氫氧化鈣及氧化鈣可降低其碳水化合物損失，同時提高青貯甘蔗尾葉的有氧穩定性。穆勝龍等（2018）分別添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌對甘蔗尾葉進行青貯，發現兩種菌均可改善甘蔗尾葉青貯效果。【本研究切入點】雖然已有不少研究甘蔗尾葉青貯的文獻報道，但至今未見針對甘蔗尾葉兩段青貯的研究報道。康奈爾凈碳水化合物—蛋白質體系（Cornell net carbohydrate and protein system，CNCPS）集飼料化學分析、植物細胞壁組分及反芻動物的消化利用于一體，利用其對青貯樣品進行營養價值評定，較尼龍袋技術、Weeden體系更能真實反映所測樣品的營養特性，提供更具參考價值的分析結果（李威等，2008）。【擬解決的關鍵問題】以新鮮甘蔗尾葉為原料，第一階段噴灑黑曲霉進行有氧發酵，第二階段噴灑乳酸芽孢桿菌進行厭氧青貯，通過CNCPS評定黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯對甘蔗尾葉營養價值的影響，以期為甘蔗尾葉有效利用和青貯飼料研究提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

甘蔗尾葉取自廣西崇左市扶綏縣甘蔗種植區，人工收割，切碎至2 cm備用，新鮮甘蔗尾葉的常規營養成分見表1。黑曲霉和乳酸芽孢桿菌由廣西九通王環保生物工程有限公司贈送。

土豆液體和固體培養基用于黑曲霉和乳酸芽孢桿菌活化及菌落計數。土豆液體培養基：200 g土豆，添加1 L蒸餾水，煮沸15 min，3層紗布過濾，濾液添加20 g葡萄糖微熱溶解，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌15～20 min。土豆固體培養基：在土豆液體培養基中加1.5%瓊脂煮沸熔化，121 ℃滅菌15～20 min。

1. 2 菌落計數

乳酸芽孢桿菌接種液：采用平板計數法，將乳酸芽孢桿菌菌種培養至第二代進行甘蔗尾葉青貯接種，用無菌水對其接種菌液逐級稀釋，對10-5、10-6和10-7 3個稀釋梯度進行平板涂布，每個梯度3次重復，37 ℃厭氧培養48 h后計數。

黑曲霉接種液：在接種液中加入玻璃球，振蕩器振蕩后以3層紗布過濾，用無菌水對所得孢子懸浮液逐級稀釋，采用血球計數法計算黑曲霉孢子濃度。

1. 3 試驗設計

試驗設4個組，即對照組、試驗I組、試驗II組和試驗III組，每組3個重復，分兩個階段進行。第一階段有氧發酵：對照組、試驗I組、試驗II組和試驗III組每千克樣品分別對應噴灑100 mL無菌水、10 mL黑曲霉菌液+90 mL無菌水、20 mL黑曲霉菌液+80 mL無菌水、30 mL黑曲霉菌液+70 mL無菌水，在無菌室室溫下有氧發酵48 h;第二階段無氧青貯：對照組每千克樣品噴灑100 mL無菌水，3個試驗組每千克樣品均噴灑10 mL乳酸芽孢桿菌菌液+90 mL無菌水，青貯原料與添加劑充分混勻，罐裝密封，室溫青貯45 d后取樣分析。黑曲霉菌液濃度為8.75×107 CFU/mL，乳酸芽孢桿菌菌液濃度為1.1×108 CFU/mL。

1. 4 測定項目及方法

各試驗組樣品經風干、粉碎過1 mm網篩處理后，儲存于樣品袋中，以備分析。干物質（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）和粗灰分（Ash）參照AOAC（1990）的方法進行測定，中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、酸性洗滌不溶蛋白（ADIP）、中性洗滌不溶蛋白（NDIP）和木質素（Lignin）參照van Soest等（1981）的方法進行測定，可溶性粗蛋白（SOLP）參照Krishnamoorthy等（1983）的方法進行測定。

1. 4. 1 CNCPS碳水化合物計算 根據下列公式（Sniffen et al.，1992）進行計算：

式中，CHO為總碳水化合物，Strach為淀粉，CB1為中速降解碳水化合物，CB2為緩慢降解碳水化合物，CA為快速降解碳水化合物，CC為不可利用碳水化合物（木質素×2.4），NSC為非結構性碳水化合物。

1. 4. 2 CNCPS蛋白組分計算 根據下列公式（Sniffen et al.，1992）進行計算：

式中，PA為非蛋白氮（NPN），PB1為快速降解真蛋白，PB2為中速降解真蛋白，PB3為慢速降解真蛋白質，PC為與單寧、木質素結合不能被機體消化利用的蛋白部分。

1. 5 統計分析

試驗數據采用Excel 2016進行初步處理，應用SPSS 16.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），同時進行Duncan’s新復極差多重比較。

2 結果與分析

2. 1 黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯對甘蔗尾葉常規營養成分的影響

由表2可知，各組間的干物質和中性洗滌纖維含量差異均不顯著（P>0.05，下同），其中3個試驗組的干物質含量較對照組均有提高，而中性洗滌纖維含量較對照組均有降低;各組間的粗蛋白含量差異顯著（P<0.05，下同），試驗I組和試驗III組顯著高于對照組，而試驗II組顯著低于對照組;3個試驗組的粗脂肪含量均顯著高于對照組，但試驗組間差異不顯著;對照組和試驗I組的酸性洗滌纖維含量顯著高于試驗II組和試驗III組;試驗II組的粗灰分含量顯著高于另外2個試驗組和對照組，試驗I組和試驗III組的粗灰分含量差異不顯著，但二者顯著低于對照組。

2. 2 黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯對甘蔗尾葉CNCPS營養指標的影響

由表3可知，可溶性粗蛋白、中性洗滌不溶蛋白和木質素在各組間均存在顯著差異，其中試驗I組和試驗II組的可溶性粗蛋白含量顯著高于對照組，3個試驗組的中性洗滌不溶蛋白含量均顯著高于對照組，而3個試驗組的木質素含量均顯著低于對照組。非蛋白氮（NPN）含量以試驗I組最高，顯著高于對照組和其余2個試驗組;對照組和試驗III組的酸性洗滌不溶蛋白含量差異不顯著，但二者顯著高于試驗I組和試驗II組;淀粉含量以試驗III組最高，試驗II組最低，二者與對照組和試驗I組間存在顯著差異。

2. 3 黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯對甘蔗尾葉CNCPS碳水化合物組分的影響

由表4可知，試驗III組的總碳水化合物、非結構性碳水化合物、快速降解碳水化合物、中速降解碳水化合物和緩慢降解碳水化合物含量均最高，且顯著高于對照組和另外2個試驗組，但其不可利用碳水化合物含量最低，顯著低于對照組和另外2個試驗組;對照組的非結構性碳水化合物、快速降解碳水化合物和緩慢降解碳水化合物含量均最低，顯著低于3個試驗組，但其不可利用碳水化合物含量最高，顯著高于3個試驗組;中速降解碳水化合物含量則以試驗II組最低。

2. 4 黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯對甘蔗尾葉CNCPS蛋白組分的影響

由表5可知，試驗II組和試驗III組的非蛋白氮含量顯著低于對照組和試驗I組，但二者間差異不顯著，以試驗I組的非蛋白氮（PA）含量最高;快速降解真蛋白和慢速降解真蛋白含量以試驗II組最高，其次是試驗III組，二者間存在顯著差異，且均顯著高于對照組和試驗I組，但試驗II組的中速降解真蛋白含量最低，顯著低于對照組和試驗I組;對照組的不可利用蛋白含量最高，顯著高于各試驗組，但其慢速降解真蛋白含量顯著低于各試驗組。

3 討論

3. 1 兩段青貯對甘蔗尾葉常規營養成分的影響

粗蛋白是衡量青貯飼料營養價值的重要指標之一。在青貯過程中，蛋白質在植物酶的作用下降解為氨基酸、多肽等非蛋白氮，非蛋白氮在微生物作用下進一步降解為氨，進而影響青貯飼料的營養價值。本研究中，黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯甘蔗尾葉，試驗I組和試驗III組的粗蛋白含量較對照組均顯著提高，可能是青貯過程中乳酸菌分泌有機酸，致使pH降低，從而抑制植物酶活性。張寧等（2013）研究發現乳酸菌劑可提高青貯水稻秸的粗蛋白水平，賴玉嬌等（2014）研究發現乳酸菌劑可提高青貯苜蓿的粗蛋白水平，本研究結果與上述研究結果一致。動物機體利用纖維很大程度上是利用微生物酶的分解產物或微生物的代謝產物。日糧纖維素水平提高，加快食糜在消化道中的流通，影響機體對淀粉、蛋白質、脂肪等營養物質的吸收，降低飼糧可利用能值，但同時纖維是反芻動物的一種必要營養素。美國國家研究理事會（NRC）推薦泌乳牛飼糧中酸性洗滌纖維水平至少為19%～21%或中性洗滌纖維水平為25%～28%，且日糧中中性洗滌纖維總量的75%必須由粗飼料提供（楊鳳，2000）。纖維素酶降解植物的半纖維素和纖維素，增加青貯發酵底物，提高青貯飼料的消化率及采食量（莊益芬等，2009）。本研究中，試驗組與對照組間中性洗滌纖維含量差異不顯著，但各試驗組較對照組均有所降低，3個試驗組的酸性洗滌纖維含量也低于對照組，說明黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯在一定程度上可降低青貯甘蔗尾葉的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，可能是黑曲霉分泌積累纖維素酶及兩種菌的互作效應提高了青貯甘蔗尾葉適口性及營養價值。

3. 2 兩段青貯對甘蔗尾葉CNCPS營養成分的影響

動植物體中的非蛋白氮（NPN）包括酰胺類、游離氨基酸、生物堿、銨鹽、含氮的糖苷及脂肪、硝酸鹽、甜菜堿、膽堿等（楊鳳，2000）。非蛋白氮在反芻動物營養中具有重要意義，但對于非反芻動物基本上沒有利用價值。本研究中， 試驗I組的非蛋白氮含量顯著高于對照組，試驗II組和試驗III組間差異不顯著，但顯著低于對照組，說明試驗II組和試驗III組可改善青貯甘蔗尾葉營養價值。淀粉是瘤胃內產生揮發性脂肪酸的主要底物，且高水平淀粉有利于瘤胃微生物發酵產生揮發性脂肪酸，試驗III組淀粉含量顯著高于其他組，說明試驗III組可為反芻動物提供較多的能量來源。

飼料中蛋白肽鏈上的氨基酸殘基與碳水化合物中的半纖維素結合生成聚合物，該聚合物含有11%的氮，但完全不能被瘤胃微生物分解，該聚合物的檢測分析過程與酸性洗滌纖維相同，所含氮被稱為酸性洗滌不溶氮，70%相對濕度及60 ℃溫度是酸性洗滌不溶氮生成的最適宜環境，時間越久，生成的酸性洗滌不溶氮越多。本研究中，試驗I組和試驗II組的酸性洗滌不溶蛋白含量顯著低于對照組，可能是試驗過程中青貯原料填充的緊密程度造成相對濕度及溫度有偏差所致。木質素是植物生長成熟后才出現在細胞壁中的物質，動物機體所分泌的酶均不能使其降解（楊鳳，2000）。本研究中，各試驗組木質素含量均顯著低于對照組，且以試驗III組含量最低，可能是黑曲霉分泌降解酶或兩種菌本身消化分解青貯甘蔗尾葉的木質素。

3. 3 兩段青貯對甘蔗尾葉CNCPS碳水化合物組分的影響

碳水化合物是多羥基的酮、醛或其簡單衍生物及能水解產生上述化合物的總稱（楊鳳，2000）。碳水化合物是一類重要的營養素，占動物飼糧的50%以上。依照CNCPS將碳水化合物劃分為非結構性碳水化物（Non-structural carbohydrate，NSC）和結構性碳水化合物（Structural carbohydrate，SC）。其中緩慢降解碳水化合物和不可利用碳水化合物劃歸結構性碳水化合物，快速降解碳水化合物和中速降解碳水化合物劃歸非結構性碳水化合物。結構性碳水化合物是反芻動物重要的碳架及能量來源，非結構性碳水化合物會影響反芻動物瘤胃能氮代謝及瘤胃發酵。本研究中，試驗III組的總碳水化合物、非結構性碳水化合物、快速降解碳水化合物、中速降解碳水化合物和緩慢降解碳水化合物含量均最高，說明試驗III組CNCPS碳水化合物組分最優，可能是隨著黑曲霉添加量的增加，纖維素酶、木聚糖酶等積累越多，同時黑曲霉和乳酸芽孢桿菌自身的消化代謝促使試驗III組CNCPS碳水化合物組分最優。目前，有關添加劑對青貯飼料CNCPS碳水化合物組分的影響研究較少，而兩段青貯對青貯甘蔗尾葉CNCPS碳水化合物組分的影響研究尚無報道，因此兩段青貯的機理有待進一步研究。

3. 4 兩段青貯對甘蔗尾葉CNCPS蛋白組分的影響

CNCPS依據蛋白在瘤胃內的降解特性，將其劃分為非蛋白氮（PA）、真蛋白（PB）和結合蛋白（PC）三部分，其中PB又被劃分為快速降解真蛋白（PB1）、中速降解真蛋白（PB2）和慢速降解真蛋白（PB3）三部分。結合蛋白（不可利用蛋白）包括與木質素結合的蛋白、單寧蛋白復合物及高度抵抗微生物及哺乳動物酶類的蛋白，其在實驗室分析過程中不被酸性洗滌劑溶解，在瘤胃微生物也無法降解，動物機體不能消化吸收。青貯飼料中梭菌等有害菌的活動及蛋白水解酶的作用，可引起青貯飼料中蛋白含量的變化。飼料中不可利用蛋白含量越低，其蛋白生物學效價越高。中速降解真蛋白和慢速降解真蛋白在反芻動物瘤胃中的降解速率分別為中速和慢速，部分可進入小腸形成瘤胃蛋白，對提高反芻動物生產性能具有顯著作用（Anil et al.，2000）。本研究中，各試驗組的快速降解真蛋白和慢速降解真蛋白含量均高于對照組，不可利用蛋白含量低于對照組。在第二階段厭氧青貯，乳酸芽孢桿菌在厭氧環境下大量繁殖，產生有機酸使青貯pH下降，抑制梭菌等有害菌的活動及青貯原料自身所帶蛋白酶的活性，減少其對蛋白的破壞。由上述結果可知，各試驗組蛋白生物學效價均高于對照組，黑曲霉和乳酸芽孢桿菌兩段青貯可提高甘蔗尾葉CNCPS蛋白品質。

4 結論

綜合考慮青貯甘蔗尾葉CNCPS碳水化合物組分及蛋白組分，以試驗III組效果最佳，即2.625×106 CFU/g黑曲霉+1.1×106 CFU/g乳酸芽孢桿菌（CFU/g是菌液濃度乘以所噴灑的菌液體積，再除以該體積菌液噴灑的甘蔗尾葉質量所得）兩段青貯對改善甘蔗尾葉營養價值效果最佳。

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（責任編輯 羅 麗）