弱光脅迫對煙草幼苗抗氧化系統及相關基因表達的影響

關曉溪　隋常玲　胡海軍　吳亞男　吳燕

摘要：【目的】探討弱光脅迫對煙草幼苗抗氧化系統及相關基因表達的影響，為后續開展煙草遺傳改良提供科學依據。【方法】以自然光（12000 lx）為對照（CK），設T1（7500 lx）、T2（4500 lx）和T3（2500 lx）3個弱光脅迫處理，于煙苗生長至大十字期時隨機取樣測定不同光照處理下煙草幼苗的抗氧化系統相關指標，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測調控響應光信號內源物質相關基因的差異表達模式，并分析基因表達對脅迫抗性的影響。【結果】一定程度的弱光（7500和4500 lx）脅迫可使煙苗葉片的脯氨酸（Pro）含量上升，可溶性蛋白含量下降，丙二醛（MDA）含量升高，超氧陰離子產生速率提高，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性提高;而重度弱光（2500 lx）脅迫導致抗氧化酶活性大幅度下降，證明重度弱光導致煙苗生長過弱，其體內的防御酶系統不足以抵抗逆境脅迫。在此過程中，煙草生長素早期反應基因GH3.6、過氧化物酶類似物基因peroxidase P7-like和細胞色素基因P450的表達均在輕度弱光（7500 lx）脅迫時下調，在重度弱光（2500 lx）脅迫時進一步下調;抗病蛋白基因RGA3在重度弱光脅迫下顯著下調（P<0.05）。【結論】一定程度的弱光脅迫能激活煙草幼苗抗氧化系統，抑制幼苗內源物質相關基因的表達，推測其參與了煙草的光信號應激反應。

關鍵詞： 煙草幼苗;弱光脅迫;生長發育;基因表達

中圖分類號：S572.01 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-0957-07

Abstract：【Objective】The effect of low light intensity stress on tobacco seedlings antioxidant system and expression of related genes were explored to provide scientific basic for tobacco genetic improvement in the future. 【Method】Taking natural light（12000 lx） as control（CK），three low light stress treatments T1（7500 lx），T2（4500 lx） and T3（2500 lx） were set up. Antioxidant system indexes of randomly sample of tobacco seedlings during the big cross period in different light treatments were determined. Then real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） method was used to analyze the expression patterns of genes involved in endogenous substances responding to low light intensity stress in tobacco seedlings. Finally，the influence of gene expressions on stress resistance was also analyzed. 【Result】A certain degree of low light stress（7500 and 4500 lx）initiated a dramatic increase of the ?proline（Pro） and malonaldehyde（MDA） contents in tobacco leaves，superoxide anion production rate and antioxidant enzyme activity，including superoxide dismutase（SOD），peroxidase（POD） and catalase（CAT），while a decrease of soluble protein content. However，serious stress（2500 lx） led to antioxidant enzyme activity decrease to a very low level，which proved that serious light stress led to the weak growth of the seeding，and the internal defensive enzyme system was insufficient to resist stress. In this process，the expression of auxin early response gene GH3.6，peroxidase analog gene peroxidase P7-like and cytochrome gene P450 were all down-regulated under mild low light stress（7500 lx），further down-regulated under severe low light stress（2500 lx），and disease resistance protein（RGA3） was down-regulated significantly under severe low light stress（P<0.05）. 【Conclusion】The results show that a certain degree of low light stress activates tobacco seedlings antioxidant system and inhibits the expression of these genes，which might be involved in the light signal stress response in tobacco.

Key words： tobacco seeding; low light intensity stress; development and growth; gene expression

0 引言

【研究意義】煙草（Nicotiana tabacum L.）為喜光作物。貴州是我國西南煙草種植區的重要組成部分，也是重要的優質烤煙產地，擁有得天獨厚的生態環境;但貴州地處我國西南部，全年太陽輻射和日照時數較少，且冬季育苗時通常選擇設施育苗，在保證溫度條件的同時加劇了弱光脅迫作用，直接影響到煙苗品質。已有研究表明，一定程度的弱光脅迫會引起植物抗氧化酶系統中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性升高，同時引起脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量的顯著響應（Iriti and Faoro，2009）。因此，探討弱光脅迫對煙草幼苗抗氧化系統的影響和相關基因的表達，對煙草的抗性育苗及貴州烤煙生產的發展具有重要意義。【前人研究進展】近年來，有關弱光脅迫對植物光合、生理生化等影響的研究多集中在低溫弱光兩因素脅迫，研究對象多以設施蔬菜幼苗為主，包括辣椒和番茄等（張淑杰等，2014;王春萍等，2015;王勤禮等，2015;李雅潔等，2018）。侯偉等（2015）研究發現，低溫弱光脅迫下西瓜幼苗的MDA含量上升，SOD和POD活性先上升后下降，CAT活性持續下降。馬曉麗（2015）研究發現，隨著光照強度減弱，大白菜幼苗的抗氧化酶活性整體呈升高趨勢，同時結合干旱脅迫處理，發現其過氧化氫（H2O2）和MDA含量并未發生變化，抗氧化酶活性也維持原有水平。圍繞弱光下植物抗氧化系統的相應響應，何靜雯等（2018）對弱光脅迫下葡萄抗氧化酶系統及相關基因表達的研究表明，隨著脅迫程度的加深，植株葉片中CAT、SOD和POD活性先升高后快速下降，與可溶性蛋白含量變化一致，Pro和MDA含量與脅迫程度呈正相關，MYC2和TRX基因表達先上調后下降;劉新等（2018）研究表明，隨光強減弱，金銀花葉片的SOD、CAT和POD活性先升后降，MDA含量增加;羅亢等（2018）研究表明，耐弱光脅迫型晚稻品種的葉片在弱光脅迫下能維持較高的CAT和SOD活性，POD活性差異不顯著。關于弱光脅迫對煙草生理特性的研究多集中于成苗移栽后的生長和品質調查（倪國仕等，2014;李正付等，2016），而有關苗期抗氧化系統的相關研究較少。煙草苗期在逆境脅迫下極易引發病害，抗病基因同源物（RGA）參與植物抗病反應過程，目前多集中于基因克隆和結構分類研究（Meyers et al.，2003;袁清華等，2014）。GH3（Gretchen Hagen 3）基因是一類生長素早期響應基因家族，響應參與生長素途徑相關的早期脅迫反應（Lavy and Estellle，2016）。細胞色素P450參與植物多種代謝活動，且在此過程中產生一些增強抵御逆境脅迫及病蟲害的次生代謝產物。Fu等（2009）利用基因組學分析煙草P450基因家族的某些成員表現組織特異性表達，推測其與煙草抗性相關。可見，這些基因對于提高煙草抗逆性具有重要意義。【本研究切入點】目前，對弱光脅迫下煙草苗期抗氧化物質的調查，尤其是有關特異性調控煙草響應弱光脅迫的內源物質相關基因表達分析的研究尚無報道。【擬解決的關鍵問題】以烤煙品種云煙87為試驗材料，于煙苗大十字期隨機取樣測定不同光照處理煙苗的抗氧化系統指標，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測調控響應光信號內源物質相關基因的差異表達模式，并分析基因表達對脅迫抗性的影響，探討弱光脅迫對煙草幼苗抗氧化系統的影響及相關基因表達，為后續開展煙草遺傳改良提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗在遵義師范學院人工氣候室進行。供試烤煙品種為云煙87（貴州省遵義市煙草公司遵義縣樂山煙草科技園提供），采用16×10穴盤漂浮育苗。

1. 2 試驗方法

以自然光（12000 lx）為對照（CK），由人工氣候室提供相應環境條件，設T1（7500 lx）、T2（4500 lx）和T3（2500 lx）3個弱光脅迫處理，光周期設定12 h/12 h（晝/夜），培養溫度為28 ℃/25 ℃（晝/夜）。每處理3次重復。于煙苗大十字期隨機取樣測定煙草幼苗抗氧化系統相關指標;取T1和T3處理幼苗葉片進行qRT-PCR檢測。其他管理參照常規育苗方法。

1. 3 測定項目及方法

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定;MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定;Pro含量采用茚三酮顯色法測定;超氧陰離子產生速率采用羥胺氧化法測定;SOD活性采用NBT法測定;CAT活性采用過氧化氫法測定;POD活性采用愈創木酚法測定。

相關基因表達qRT-PCR分析選用的植物總RNA提取試劑盒、FastQuant RT Super Mix試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，方法參照試劑盒說明。基于研究團隊前期構建的煙草幼苗轉錄組數據庫，獲取調控抗性內源物質相關目的基因序列信息，應用DNAMAN軟件設計目的基因表達qRT-PCR分析特異引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。參照天根Talent熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）的方法，參考BIO-RAD公司CFX Connect Real-Time System的qRT-PCR程序進行qRT-PCR檢測。設置3次生物學重復，擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，進行40個循環。

1. 4 統計分析

利用Excel 2007和SPSS 20.0進行試驗數據的統計分析和作圖，采用LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2. 1 不同光照處理對煙苗Pro和可溶性蛋白含量的影響

Pro是一種重要的滲透調節物質，逆境脅迫可使Pro在植物體內大量積累。由圖1-A可看出，隨著光照強度的減弱，煙苗葉片的Pro水平迅速增加，光照強度為4500 lx（T2處理）時Pro含量達最大值，為104.5 μg/gFW;光照強度繼續減弱至2500 lx（T3處理）時，煙苗葉片的Pro含量則出現大幅度下降，顯著低于其他處理（P<0.05，下同）。由此可知，一定程度的弱光誘導可顯著上調煙苗葉片的Pro含量，光照強度過低反而會導致Pro含量大幅度衰減，可能是由于幼苗生長過弱所導致。

可溶性蛋白是植物體內一種重要的結構性物質，不良環境會降低其在植物體內的含量，影響植物正常的代謝平衡。由圖1-B可看出，隨著光照強度的持續減弱，煙苗葉片的可溶性蛋白含量顯著下降，光照強度為2500 lx（T3處理）時達最低值，且各處理間差異均達顯著水平。

2. 2 不同光照處理對煙苗MDA含量和超氧陰離子產生速率的影響

逆境脅迫會使細胞膜系統受損，MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一;多種不良環境還會導致植物體內產生大量的活性氧與自由基，其含量的積累能反映植物受外界環境脅迫的程度。由圖2可看出，光照強度減弱使煙苗葉片的MDA含量和超氧陰離子產生速率均持續上升;光照強度為4500 lx（T2處理）時，兩個指標均較CK顯著升高;光照強度為2500 lx（T3處理）時，二者均達最大值。由此可見，弱光脅迫可導致煙苗葉片內MDA積累量顯著升高，超氧陰離子產生速率也隨弱光脅迫程度的加深而加快。

2. 3 不同光照處理對煙苗抗氧化保護酶系統的影響

抗氧化保護酶系統能清除逆境脅迫下植物體內產生的活性氧與自由基，緩解逆境傷害。SOD是保護酶系統的第一道防線，可歧化自由基和活性氧為H2O2，CAT和POD是清除H2O2的保護酶。由圖3可看出，光照強度減弱使煙苗葉片的抗氧化酶活性迅速增加;與CK相比，T1和T2處理顯著上升，且均在T2處理達最大值;但光照強度繼續減弱時，3種抗氧化酶活性均出現較大幅度下降。由此可知，一定程度的弱光刺激會顯著提高煙苗體內的SOD、CAT和POD活性，但光照強度過低會抑制保護酶系統的各種酶活性，出現此情況的原因可能是弱光導致植株生長過弱，抗氧化保護系統酶活性過低，削弱了植株的抗氧化能力。

2. 4 弱光脅迫下煙草幼苗內源物質相關基因的差異表達

取T1和T3處理下大十字期煙草幼苗葉片分析其內源物質相關基因的表達情況。由圖4可知，煙草生長素早期反應基因GH3.6、過氧化物酶類似物基因peroxidase P7-like和細胞色素基因P450的表達均在輕度弱光脅迫時顯著下調，在重度弱光脅迫時進一步顯著下調;而抗病蛋白基因RGA3在輕度弱光脅迫下的表達與CK無顯著差異（P>0.05），在重度弱光脅迫下顯著下調。可見，上述基因對弱光脅迫表現特異性響應，輕度脅迫或重度脅迫下表達受到不同程度的抑制，可能參與了煙草在弱光脅迫下的應激反應。

3 討論

當一定程度的逆境脅迫阻礙植物體合成蛋白時，植物會增加某些蛋白的含量來適應環境。植物體內可溶性蛋白和Pro等滲透調節物質均會響應環境脅迫，Pro是細胞滲透調節物質之一，在脅迫環境下調節一系列代謝反應（Zhang et al.，2015）。何靜雯等（2018）研究發現，弱光脅迫下葡萄葉片的Pro含量與脅迫程度呈正相關，而可溶性蛋白含量先升高后下降，證明適度遮陰在一定程度上有利于葡萄生長，但重度脅迫造成的傷害不可逆，植物自身已無法通過適應反應進行應激調節。本研究結果表明，苗期一定程度的弱光誘導可顯著上調煙苗葉片內的Pro含量，但隨著弱光脅迫程度的加深，Pro含量開始大幅降低;而可溶性蛋白含量隨脅迫程度的加劇同步下降，與何靜雯等（2018）的結論不完全相同，可能是由于重度弱光脅迫嚴重破壞了煙苗內部的生理平衡，使其無法積累更多的Pro來抵御不良環境的傷害。

脅迫條件下植物細胞膜脂過氧化加劇會導致MDA大量積累，使細胞受損，而抗氧化酶系統中CAT、POD和SOD等保護酶能清除活性氧和自由基，與植物抗逆密切相關（Sridevi and Chellamuthu，2015）。楊興有等（2008）研究表明，隨著光強的降低，成苗移栽后煙草葉片內MDA含量逐漸升高，同時POD活性降低。倪國仕等（2014）研究表明，與全光照相比，一定程度的遮光能刺激煙草葉片成熟期POD和SOD活性提高。李正付等（2016）研究表明，煙草成苗移栽后，弱光脅迫可使其體內MDA含量上升，旺長期MDA含量增加，導致膜脂過氧化，影響煙苗最終的生長發育及品質形成。本研究發現，隨著弱光脅迫加劇，煙苗葉片內的超氧陰離子產生速率提高，MDA含量亦顯著升高，與楊興有等（2008）、李正付等（2016）的研究結果相似;同時苗期弱光刺激顯著提高了煙苗體內的SOD、CAT和POD活性;但隨著弱光脅迫程度的加深，抗氧化酶活性開始大幅度下降，說明煙苗內部的代謝被破壞，自我調節能力減弱，體內的防御酶系統不足以抵抗由于脅迫而產生的自由基與活性氧，導致有害物質在煙苗體內積累過量，致使煙苗的生長發育受阻，與侯偉等（2015）對西瓜幼苗的研究一致。

作為植物的重要保護酶類，POD基因在植物的脅迫響應中發揮著重要作用（Ren et al.，2014）。目前研究表明，植物POD基因在同種或不同種脅迫下的表達并不一致。銀杏在干旱及ABA脅迫下其POD1基因表達下調，同時其表達被重金屬及一些傷害顯著誘導（程華等，2010）;而甘蔗POD2基因在干旱、ABA及鹽脅迫下其表達量上調（蘇亞春等，2017），同時其表達受H2O2誘導;對白楊的研究顯示，其POD1基因在干旱脅迫下表達亦下調（Bae et al.，2006）;王海波等（2017）對小桐子的研究發現，其POD73基因被低溫誘導表達上調。煙草POD是一類具有功能多樣性的基因家族，目前已有相關克隆和表達分析。楊尚諭等（2018）對克隆得到的煙草POD1基因進行多種脅迫條件下的表達模式分析，結果發現NtPOD1基因的表達受鹽脅迫抑制，并受H2O2和低鉀脅迫的誘導上調。此外，有學者結合POD活性及其基因表達分析展開相關研究。黃瓜葉片的POD活性在脅迫14 d以前升高，而后下降，同時其POD基因在第14 d表達上調，而后下調（張之為等，2017）;同樣利用高溫處理，對兩個水稻品種的調查發現，其POD活性在脅迫第3 d前升高，而后下降，同時在脅迫第7 d，G725品種POD基因表達大幅下調，而II838品種POD基因表達上調（王艷等，2015）。本研究發現，煙苗葉片的POD活性隨光照強度的減弱而提高，但重度弱光脅迫時下降，同時peroxidase P7-like基因在輕度弱光脅迫時下調，在重度弱光脅迫時進一步下調。由此可見，POD及其類似物基因在不同物種、不同脅迫條件下的表達存在差異。

GH3（Gretchen Hagen 3）基因是一類生長素早期響應基因家族，目前已陸續在植物中克隆獲得（曾文芳等，2015）。研究表明，除在植物生長發育生理進程中的作用外，大豆GH2/4還被H2O2、鹽及重金屬等脅迫信號誘導，參與某些脅迫的反應過程。對擬南芥幼苗形態學的觀察發現，其子葉、真葉和根部的生長受氧化脅迫影響，而這種影響與GH3蛋白調控生長素的含量水平和機體內的動態分配有直接關系（Pasternak et al.，2005）。基因芯片結果顯示，在所檢測的207個煙草腺毛優勢表達基因中，P450基因與生物堿代謝及防御反應等密切相關（Cui et al.，2011）。本研究發現，GH3.6和P450基因在輕度弱光脅迫時下調，在重度弱光脅迫時進一步下調，證明其可能參與了煙草的光信號應激反應。本研究發現重度弱光脅迫使抗病基因同源物（RGA）表達大幅下調，暗示脅迫干擾光信號途徑生理反應的同時，可能伴隨其他抗性因子的協同響應。

4 結論

一定程度的弱光脅迫能激活煙草幼苗抗氧化系統，抑制幼苗內源物質相關基因的表達，推測其可能參與了煙草的光信號應激反應。

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（責任編輯 王 暉）