乳清蛋白ACE抑制肽酶解工藝純化研究

[摘要]為充分利用奶酪制作的副產物——乳清蛋白增加乳制品附加值，本研究以濃縮乳清蛋白為試驗原料，采用酶解技術制備乳清蛋白ACE（Angiotensin Converting Enzyme）抑制肽。在酶的篩選試驗中，以酶解產物ACE抑制率和肽得率為指標選出最佳水解用酶為Alcalase 2.4L堿性蛋白酶，然后采用單因素試驗得到了此酶的最佳水解條件并對水解物的穩定性進行了試驗。研究結果表明，最適酶解條件為底物濃度7.5%、加酶量6 000U/g、pH值8.5、溫度55℃，得到酶解產物ACE抑制率為69.38%、IC50為0.80mg/mL，經模擬腸胃消化處理后，肽的活性并無顯著變化，穩定性較好。經葡聚糖凝膠純化后，抑制率提升至75.33%，其IC50為0.74mg/mL。

[關鍵詞]乳清蛋白;ACE抑制肽;酶解;純化

中圖分類號：Q512+.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190517

牛奶中含有豐富的蛋白質資源，已有研究表明，可將這些蛋白質水解為活性肽，而且其中一些肽段已被證明具有免疫調節、抗菌等活性功能，大大提高了牛奶的利用價值[1-5]。本研究以生產干酪副產物——乳清蛋白為原料，制備ACE抑制肽，并對制備工藝進行優化，采用超濾分級、葡聚糖凝膠層析對水解產物進行純化，制備出高活性乳清蛋白ACE抑制肽。

1? 材料與設備

1.1? 原料與試劑

主要原料與試劑見表1，其余試劑為分析純。

1.2? 儀器與設備

主要設備與儀器見表2。

2? 試驗方法

2.1? ACE抑制活性的測定

首先制備0.1 mol/L的硼酸鹽緩沖液，pH值為8.3，將HHL溶于其中，配置濃度為5 mmol/L。取100 μL配置好的HHL溶液，加入25 μL的ACE抑制劑，用電動混勻器充分混勻，放置在37 ℃水浴鍋中水浴5 min后，加入l5 μL的ACE，混勻，再放置37 ℃下溫育40 min。結束后加入120 μL、1 mol/L的HCl終止反應。再加入1.2 mL乙酸乙酯，用混勻器混合20 s，用來萃取生成HA（馬尿酸）。然后離心10 min，轉速為1 200 r/min，靜止后從中吸取0.9 mL上層溶液，滴入試管中，放入100 ℃的烘箱烘干，烘干后取出試管，加入3 mL去離子水溶解，混勻器混勻后于228 nm下測定吸光值[6-7]。抑制率計算式：

ACE抑制率=[（對照組-樣品組）÷（對照組-空白組）]×100%? ? ? ? ? ?（1）

抑制率達到50%時的抑制劑濃度為半抑制濃度，記為IC50。

2.2? 肽得率的測定

肽得率以氮溶指數（TCA-NSI）表示，將等體積的水解液與15%三氯乙酸（TCA）混合均勻，靜置20 min后離心15 min，轉速為1200 r/min，采用微量凱氏定氮法測定上清液中蛋白質的含量[8]。肽得率計算公式：

肽得率=（N÷N0）×100%? ? ? ?（2）

式中：N為經TCA處理后上清液中的總氮;N0為未經TCA處理的水解液中的總氮。

2.3? 乳清蛋白ACE抑制肽水解用酶的篩選

首先要對蛋白酶進行篩選，根據龔琴等[9-10]的研究，篩選最適條件下的胃蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，加酶量為5 000 U/g，底物濃度為5%。以ACE抑制率和肽得率為指標，經比較分析得出最適宜水解乳清蛋白的蛋白酶。

稱取一定量的乳清蛋白，加入去離子水配置成所需濃度，沸水預煮10 min使蛋白質中的酶失活，再降溫至酶解所需溫度，調節后加入蛋白酶。在酶解過程中，要用堿式滴定管不斷滴入NaOH使pH值維持在最適范圍之內，當pH值不再變化時，水解完畢。將水解液在沸水浴中不斷攪拌15～20 min，使酶失活，然后以1 200 r/min離心分離15 min，取上清液經冷凍干燥制得ACE抑制肽。

2.4? 酶解工藝單因素試驗

酶解工藝單因素試驗水平梯度見表3。

3? 單因素試驗結果

3.1? 最佳水解用酶的確定

不同蛋白酶對ACE抑制率影響見圖1。據圖1可知，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后的ACE抑制率效果較好，其中Alcalase 2.4L堿性蛋白酶在水解2 h后抑制率最高為53%，木瓜蛋白酶最大ACE抑制率也可達到48%，但水解時間較長，為4h，效率較低。在達到最大ACE抑制率后，隨著水解時間延長，ACE抑制活性均有所降低，這可能是由于產生了對具有ACE活性的基作用有影響的水解產物，從而導致ACE抑制率下降。

不同蛋白酶對肽得率的影響見圖2。據圖2可知，隨著水解時間增加，5種蛋白酶的肽得率均呈不斷上升趨勢，最后趨于平穩，其中堿性蛋白酶肽得率最大能達到42%。當水解時間足夠長時，水解程度不再增加。根據ACE抑制率和肽得率兩項指標可以得出堿性蛋白酶為最佳水解用酶。以下試驗用酶均為Alcalase 2.4L堿性蛋白酶。

3.2? pH值對乳清蛋白肽ACE抑制率和肽得率的影響

不同pH值對乳清蛋白肽ACE抑制率和肽得率的影響見圖3。

據圖3可知，隨著pH值的升高，肽得率和ACE抑制率有明顯增大，當pH值達到8.5時，肽得率達到最大，為34%，此時ACE抑制率也達到最大，為65%。當水解堿性環境繼續增強，肽得率和ACE抑制率呈下降趨勢。由此得出，Alcalase 2.4L堿性蛋白酶最適水解pH值為8.5。

3.3? 加酶量對乳清蛋白肽ACE抑制率和肽得率的影響

不同加酶量對乳清蛋白肽ACE抑制率和肽得率的影響見圖4。據圖4可知，反應初期，肽得率和抑制率均隨著加酶量的增加而增大，反應的速度也逐漸增快，但加酶過多會使水解程度過大，這可能是破壞了肽鏈的活性基團，造成活性下降。因此，加酶量6 000 U/g較為合適。

3.4? 溫度對ACE抑制率和肽得率的影響

ACE抑制率和肽得率受試驗溫度的影響程度見圖5。據圖5可知，隨著溫度升高，55 ℃之前，兩項指標逐漸上升;升高到55 ℃以上后，指標均下降，且相對同步。經過分析，可能的原因是溫度促使蛋白質結構變化，相關官能團發生反應，酶解效率不斷受到影響，導致活性下降。由此可得出，55 ℃可視為最佳試驗溫度。

3.5? 底物濃度對ACE抑制率和肽得率的影響

ACE抑制率和肽得率受底物濃度的影響程度見圖6。據圖6可知，底物濃度升高能夠促使反應更好進行，濃度達到一定程度后，反應體系的流動性大幅下降，蛋白質分子運動速率變慢，底物與酶的接觸不夠活躍，呈現出反應被抑制趨勢。由此可得出，7.5%為最佳底物濃度。

由5項單因素試驗的結果可以看出，制備乳清蛋白ACE抑制肽最適合的水解酶是堿性蛋白酶，水解條件可確定為酶添加量6 000 U/g、pH值8.5、溫度55 ℃、底物濃度7.5%。以上條件下，ACE抑制率為69.38%，IC50為0.80 mg/mL。

4? ACE抑制肽體外模擬消化穩定性試驗

4.1? 試驗方法

4.1.1? 模擬人體胃液試驗

配置胃液：取稀鹽酸1.6 mL，分別加80 mL水、胃蛋白酶1 g，混合均勻后，用水稀釋到100 mL。

取固體肽產品40 mg，取12 mL胃液進行溶解，在37 ℃條件下水浴3.5 h，沸水滅酶15 min，在10 000 r/min條件下，離心分離15 min，取上清液進行ACE抑制活性檢測。

4.1.2? 模擬人體腸液試驗

配置腸液：取磷酸二氫鉀0.68 g，加100 mL水溶解，取0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8，加入胰蛋白酶10 g，混合均勻后，稀釋至1 000 mL。

重復模擬人體胃液試驗。

4.2? ACE抑制肽體外模擬消化對活性的影響

ACE抑制肽體外模擬消化對活性的影響見圖7。

據圖7可知，ACE抑制肽由胃、腸兩種消化液分別處理后，抑制活性下降不大[11-14]。

5? ACE抑制肽的純化

選取分離分子量為5 000 U、3 000 U和1 000 U的超濾膜開展分離試驗，可以獲得4種不同分子量的成分，分別是分子量大于5 000 U的肽I、分子量在3 000～5 000 U的肽Ⅱ、分子量在1 000～3 000 U的肽Ⅲ、分子量小于1 000 U的肽Ⅳ。逐一測定4種不同分子量區間肽的活性。

5.1? 分子量不同的肽段與活性的關系

不同分子量肽段與活性的相關性見圖8。

據圖8可知，分子量在1 000～3 000 U的肽段是抑制最明顯的組分，能達到75%，IC50為0.85 mg/mL。可以選擇此組分進行下一步試驗。

5.2? 葡聚糖凝膠層析法分離ACE抑制肽

采用葡聚糖凝膠層析法分離ACE抑制肽，不同類別的葡聚糖凝膠分離范圍見表4。

由表4可看出，純化1 000～3 000 U的組分，選擇葡聚糖凝膠G-15最為合適。層析分離結果見圖9，圖中的3個吸收峰，其中58～60 min的吸收峰分離效果最好。多次重復試驗后，將3個吸收峰對應組分收集，冷凍干燥后測定活性，得出結論為峰2（81.3%）>峰3（52.6%）>峰1（43.6%），目標成分在峰2對應的肽段中，測定IC50為0.74 mg/mL。

6? 結? 論

通過單因素試驗優化酶解工藝，確定了乳清蛋白ACE抑制肽的最佳用酶是堿性蛋白酶，對應最適水解條件：加酶量6 000 U/g、pH值為8.5、溫度55 ℃、底物濃度7.5%，得到的多肽抑制率為69.38%，IC50為0.80 mg/mL，模擬體外消化得到乳清蛋白ACE抑制肽能夠保持消化穩定性，經葡聚糖凝膠純化后，抑制率提升至75.33%，其IC50為0.74 mg/mL。

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收稿日期：2019-04-16

作者簡介：劉靜，女，本科，助理工程師，研究方向為發酵技術工藝優化、新產品研發、食品科學及成果推廣。