農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測(cè)能力驗(yàn)證中的品種真實(shí)性室內(nèi)分子檢測(cè)研究

楊華

摘? ?要：主要介紹了水稻品種真實(shí)性鑒定室內(nèi)分子檢測(cè)的能力驗(yàn)證方法，探討了聚丙烯酰胺凝膠、QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳和熒光毛細(xì)管電泳3種不同檢測(cè)方法的應(yīng)用分析和比較。各實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的方法開展能力驗(yàn)證以及日常的檢測(cè)工作。

關(guān)鍵詞：農(nóng)作物;種子質(zhì)量;檢測(cè)能力;驗(yàn)證;品種;真實(shí)性;分子檢測(cè)

文章編號(hào)： 1005-2690（2019）06-0127-03? ? ? ?中圖分類號(hào)： S339.31;S511? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

農(nóng)作物品種真實(shí)性鑒定一直是種子檢測(cè)中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，因?yàn)榻陙矸N子市場(chǎng)上假冒偽劣、套牌侵權(quán)等違法行為屢禁不止，而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法為田間種植鑒定，其需要在作物整個(gè)生長發(fā)育期間，田間觀察其特征特性并與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)明顯的性狀差異來鑒定品種真實(shí)性，鑒定周期至少為一個(gè)生產(chǎn)周期，有時(shí)候待鑒定結(jié)果出來時(shí)，違法行為的證據(jù)都已經(jīng)過期或者消失，無法快速有效地打擊種子市場(chǎng)上的違法行為。但是近年來隨著分子標(biāo)記技術(shù)在品種鑒定中的廣泛研究和發(fā)展，這種快速、高效的檢測(cè)方法已經(jīng)開始彰顯優(yōu)勢(shì)。

2015年5月29日，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)批準(zhǔn)的國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 真實(shí)性和品種純度鑒定》第1號(hào)修改單規(guī)定，品種真實(shí)性或分子身份允許采用SSR和SNP分析標(biāo)記方法。這一規(guī)定使SSR分子標(biāo)記法同傳統(tǒng)的田間種植鑒定一樣成為國家標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可的品種真實(shí)性鑒定方法。2016年1月1日修訂后實(shí)施的新《種子法》第四十六條中明確規(guī)定，農(nóng)業(yè)、林業(yè)主管部門可以采用國家規(guī)定的快速檢測(cè)方法對(duì)生產(chǎn)經(jīng)營的種子品種進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可以作為行政處罰依據(jù)。這款法律條文明確了快速檢測(cè)方法的法律地位，至此地方法院在審理種子案件、農(nóng)業(yè)部門在查處假冒侵權(quán)等案件中，可以依據(jù)分子標(biāo)記快速檢測(cè)技術(shù)查處有關(guān)的違法行為。

江蘇省于2014年通過了原農(nóng)業(yè)部資質(zhì)認(rèn)定，取得了水稻品種真實(shí)性室內(nèi)分子檢測(cè)的資質(zhì)，成為首批獲得分子檢測(cè)資質(zhì)的省級(jí)種子質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)。檢驗(yàn)中心自取得資質(zhì)后在2014—2017年種子市場(chǎng)監(jiān)管中，分子檢測(cè)技術(shù)發(fā)揮了無可替代的作用，為多起種子案件提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持和保障。為了不斷提高中心的檢測(cè)水平，中心技術(shù)人員每年都參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的農(nóng)作物種子品種真實(shí)性室內(nèi)檢測(cè)能力驗(yàn)證。本文就2017年參加的水稻品種真實(shí)性室內(nèi)分子檢測(cè)能力驗(yàn)證進(jìn)行了分析和總結(jié)。

1? ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中用到的水稻種子樣品，由能力驗(yàn)證組織方——全國農(nóng)技推廣中心種子檢驗(yàn)處提供。共7個(gè)種子樣品，分別為對(duì)照CK08、CK24和待測(cè)樣稻DC036、稻DC037、稻DC038、稻DC039、稻DC040。

2? ?試劑耗材

植物基因組DNA提取試劑盒（DNA secure Plant Kit）天根生物公司;Taq酶（Premix Taq）TAKARA。

3? ?試驗(yàn)儀器

種子粉碎設(shè)備（SPEX Geno2010 美國）;PCR儀（Agilent）;微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific ND2000）;聚丙烯酰胺凝膠電泳儀/槽（北京六一/北京君意）;伯樂（Bio-RAD）公司的Gel Dox XR+型號(hào)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膠成像;瓊脂糖毛細(xì)管電泳設(shè)備（QIAxcel Advanced 全自動(dòng)核酸分析儀）;熒光毛細(xì)管電泳設(shè)備（ABI）。

4? ?試驗(yàn)方法

4.1? ?DNA提取

本試驗(yàn)采用水稻干種子直接提取的方法，每個(gè)樣品取20粒種子的混株樣品，使用粉碎設(shè)備磨碎后，用DNA提取試劑盒提取水稻全基因組DNA，詳細(xì)方法見試劑盒說明書。提取的DNA用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋到50 ng/μL備用。

4.2? ?PCR擴(kuò)增

采用能力驗(yàn)證指導(dǎo)書中規(guī)定的10對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，內(nèi)容見表1。

反應(yīng)體系為16.5 μL Taq酶混合物，1.5 μL DNA模板，2 μL上下游引物的混合物（其中進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳的引物5’端標(biāo)記熒光集團(tuán)）;反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃下預(yù)變性2 min;進(jìn)行32次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)（94 ℃下變性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min）;然后72 ℃下延伸8 min;最后10 ℃恒溫冷卻。

4.3? ?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)的具體方法進(jìn)行電泳和染色。染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Mage Lab 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

4.4? ?瓊脂糖毛細(xì)管電泳檢測(cè)

按照儀器操作手冊(cè)，將PCR產(chǎn)物放在儀器樣品分析臺(tái)上直接進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，并用儀器自帶的分析軟件（QIAxcel ScreenGel）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

4.5? ?熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)

將PCR產(chǎn)物稀釋40倍后，分別吸取1 μL加入到分析儀專用的96孔板中，每個(gè)孔分別加入0.1 μL內(nèi)標(biāo)和8.9 μL去離子甲酰胺，變性處理并離心后放在分析儀上進(jìn)行電泳，并用Gene Mapper Software 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

5? ?結(jié)果和分析

5.1? ?聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的方法步驟，以及本實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)化，每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)都得到了清晰電泳圖，以P01和P03兩個(gè)位點(diǎn)的圖為例，見圖1。并根據(jù)指紋圖譜對(duì)10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了讀圖分析，得到了最終的結(jié)果，見表2和表3。

5.2? ?QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳結(jié)果

本試驗(yàn)中應(yīng)用的QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳是一種新型的瓊脂糖電泳，此方法是通過將溴化乙錠染色的瓊脂糖膠制成一種預(yù)制卡夾微光采集器，片段在卡夾毛細(xì)管中移動(dòng)時(shí)通過一系列激光二極管，激發(fā)并檢測(cè)信號(hào)，信號(hào)通過光電倍增管傳至進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的軟件中，通過軟件分析生成模擬的電泳圖譜，圖譜中顯示每條毛細(xì)管中片段的帶型，以P01和P03兩個(gè)位點(diǎn)的圖為例，見圖2，圖型清晰，便于分析。

5.3? ?毛細(xì)管電泳分析

本試驗(yàn)通過標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定方法和部分步驟優(yōu)化后，在ABI3700基因分析儀器上利用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的片段類型和大小，以P01和P03兩個(gè)位點(diǎn)的圖為例，見圖3、圖4。圖中顯示兩個(gè)對(duì)照和5個(gè)樣品在這兩個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增片段的信號(hào)強(qiáng)，帶型清晰，具有各自特異的帶型，并且通過軟件分析能得出每個(gè)片段的大小數(shù)值。表4為兩個(gè)對(duì)照品種和4個(gè)樣品在P01和P03兩個(gè)位點(diǎn)上的片段大小。

5.4? ?能力驗(yàn)證結(jié)果判定

通過分析3種電泳結(jié)果各自的圖譜或峰值圖，均得到了一致的判定結(jié)果。與對(duì)照樣品CK08相比，DC036號(hào)樣品10個(gè)位點(diǎn)上均無差異;DC038號(hào)樣品在P06位點(diǎn)上有1個(gè)差異，其他位點(diǎn)無差異;DC037、DC039號(hào)樣品只在P02位點(diǎn)上無差異，其他位點(diǎn)均有差異;DC040號(hào)樣品與對(duì)照樣品在10個(gè)位點(diǎn)上均有差異，詳見表2。

與對(duì)照樣品CK24相比，DC037號(hào)樣品在10個(gè)位點(diǎn)上均無差異;DC039號(hào)樣品在P05位點(diǎn)上有1個(gè)差異，其他位點(diǎn)均無差異;DC036、DC038號(hào)樣品只在P02位點(diǎn)上無差異，其他位點(diǎn)均有差異;DC040號(hào)樣品與對(duì)照樣品在P03和P08兩個(gè)位點(diǎn)上無差異，詳見表3。本次能力驗(yàn)證的結(jié)果經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)機(jī)推廣中心判定為合格A等級(jí)，表明結(jié)果真確無誤。

6? ?結(jié)論與討論

目前，水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記鑒定方法中最常用的3種方法分別為聚丙烯酰胺凝膠電泳、QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳和ABI熒光毛細(xì)管電泳[1，2]。

本研究分別用這3種方法檢測(cè)了本年度農(nóng)業(yè)農(nóng)村部分發(fā)的能力驗(yàn)證樣品，每種方法都得到了清晰、便于分析的膠圖和峰圖，并將3種方法的結(jié)果進(jìn)行了分析和比對(duì)，均得到了一致的檢測(cè)結(jié)果。但是3種方法因?yàn)樵聿煌泊嬖诒旧淼膬?yōu)缺點(diǎn)：聚丙烯酰胺凝膠電泳成本低、結(jié)果直觀，但是操作復(fù)雜、耗時(shí)長、容易受到人為因素影響、通量也不高;QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳方法最簡(jiǎn)便，但是分辨率略低;ABI熒光毛細(xì)管電泳分辨率高，最高可達(dá)1 bp，且通量高，但是成本相對(duì)較高，程序較復(fù)雜。

各個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以在工作中根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的檢驗(yàn)方法，也可以選擇幾種方法結(jié)合的方式進(jìn)行試驗(yàn)，如先用QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行大量樣品的初篩，之后對(duì)問題品種用分辨率更高的其他兩種方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，以獲得更加高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 劉文彬，許理文，王鳳格，等.基于兩種熒光毛細(xì)管電泳平臺(tái)篩選評(píng)估玉米新型SSR 引物[J].玉米科學(xué)，2017，25（2）：24-30.

[ 2 ] 程本義，夏俊輝，龔俊義，等.SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)法在水稻DNA指紋鑒定中的應(yīng)用[J].中國水稻科學(xué)，2011，25（6）：672-676.

（收稿日期：2019-05-15）