優(yōu)效電針干預(yù)不同病理痛的脊髓P2X3機制研究

沈科展 何淑崢 孫鑫 陳揚 朱雨鑫 杜俊英 方劍喬

摘要 目的：觀察優(yōu)效電針干預(yù)對炎性痛和坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷大鼠的鎮(zhèn)痛作用及脊髓背角P2X3蛋白表達的影響。方法：實驗分2部分：1）SD大鼠完全隨機分為空白組、CFA組、100 Hz組和假電針組;2）SD大鼠完全隨機分為假SNI組、SNI組、2 Hz組和假電針組。通過足底皮下注射完全弗氏佐劑建立炎性痛模型;通過結(jié)扎并切斷左側(cè)腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)后遠端，保留腓腸神經(jīng)的方法建立坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型。于造模后1 d，100 Hz或2 Hz電針足三里、昆侖穴，持續(xù)干預(yù)3 d。采用up and down方法檢測機械縮足閾，采用免疫印跡法檢測患側(cè)脊髓背角P2X3蛋白表達。結(jié)果：1）與空白對照組比較，CFA組大鼠機械縮足閾造模后各個時間點都顯著下降，CFA組大鼠脊髓背角P2X3蛋白表達增多;與CFA組比較，電針干預(yù)1次、3次均能顯著提升機械縮足閾，電針干預(yù)3次能降低脊髓背角P2X3的蛋白表達，假電針無干預(yù)作用。2）與假SNI組比較，SNI組大鼠機械縮足閾造模后各個時間點都顯著下降，SNI組大鼠脊髓背角P2X3蛋白表達增多;與SNI組比較，電針干預(yù)1次、3次均能顯著提升機械縮足閾，電針干預(yù)3次能降低脊髓背角P2X3的蛋白表達，假電針無干預(yù)作用。結(jié)論：100 Hz電針可有效干預(yù)慢性炎性痛大鼠機械縮足閾，2 Hz電針可有效干預(yù)神經(jīng)病理痛大鼠機械縮足閾;其鎮(zhèn)痛作用可能與下調(diào)脊髓背角P2X3蛋白表達相關(guān)。

關(guān)鍵詞 優(yōu)效電針;干預(yù);炎性痛;神經(jīng)病理痛;脊髓;P2X3;機制;比較

Abstract Objective：To observe the analgesic effects of the optimal electroacupuncture intervention on the rats with inflammatory pain and sciatic nerve branch selective injury and the effect of spinal dorsal horn P2X3 protein expression.Methods：The experiment has two parts.Part I：SD rats were randomly divided into a blank group，a CFA group，a 100 Hz group and a sham electroacupuncture group.Part II：SD rats were completely randomly divided into a sham SNI group，SNI group，2 Hz group and sham electroacupuncture group.The model of inflammatory pain was established by subcutaneous injection of complete freund′s adjuvant.By ligating and cutting off the left common peroneal nerve and distal posterior tibial nerve，and preserving the sural nerve，a selective injury model of the sciatic nerve branch was established.At 1 d after molding，100 Hz or 2 Hz electroacupuncture at Zusanli（ST36）and Kunlun（BL60）acupoints continuous intervention for 3 d.the paw withdrawal thresholds was detected by up and down method，and the expression of P2X3 protein in the dorsal horn of the spinal cord on the affected side was detected by western blot.Results：Part I：Compared with the blank control group，the paw withdrawal thresholds in CFA group decreased significantly at all time points after modeling，while P2X3 protein expression in spinal dorsal horn of rats in CFA group increased.Compared with CFA group，electroacupuncture intervention once or three times can significantly improve the paw withdrawal thresholds，electroacupuncture intervention three times can reduce the spinal dorsal horn P2X3 protein expression，and sham electroacupuncture intervention has no effect.Part II：compared with the sham SNI group，the paw withdrawal thresholds were significantly decreased at all time points after modeling，and the P2X3 protein expression in the spinal dorsal horn of the service group was increased.Compared with the SNI group，1 and 3 times of electroacupuncture intervention could significantly improve the paw withdrawal thresholds，3 times of electroacupuncture intervention could reduce the protein expression of P2X3 in the spinal dorsal horn，and sham electroacupuncture intervention has no effects.Conclusion：One hundred Hz electroacupuncture can effectively interfere with the paw withdrawal thresholds of chronic inflammatory pain in rats.2 Hz electroacupuncture can effectively interfere with the paw withdrawal thresholds of neuropathologic pain in rats.Its analgesic effect may be related to down-regulating the expression of P2X3 protein in spinal dorsal horn.

Key Words Optimal electroacupuncture; Intervention; Inflammatory pain; Neuropathic pain; Spinal cord; P2X3; Mechanism; Comparison

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.005

慢性疼痛仍然是當今社會急需解決的重大和重點問題。慢性疼痛主要包括慢性炎性痛和神經(jīng)病理性痛。已有研究證明，慢性炎性痛和神經(jīng)病理痛具有相似的發(fā)生機制。P2X3主要表達于DRG中小神經(jīng)元細胞中，與慢性炎性痛和神經(jīng)病理痛均密切相關(guān)。脊髓背角在疼痛傳遞中處于重要地位，已有研究報道，坐骨神經(jīng)壓迫損傷模型中，脊髓背角P2X3蛋白表達增多[1-2];但在慢性炎性痛模型中，脊髓背角P2X3蛋白表達是否變化，目前未見研究報道。

電針具有良好的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)與頻率相關(guān)，我們前期和他人研究報道，100 Hz電針對炎性痛的干預(yù)作用最佳，2 Hz電針對神經(jīng)病理痛的干預(yù)作用最佳[3-5]。電針對慢性炎性痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與調(diào)控DRG水平的P2X3相關(guān)[6]。他人研究報道，電針對坐骨神經(jīng)擠壓損傷模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用與下調(diào)脊髓背角P2X3表達相關(guān)[2]。本研究中，我們擬建立完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性痛模型和坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷的神經(jīng)病理痛模型，觀察機械縮足閾和脊髓背角P2X3表達變化及電針的干預(yù)，比較電針對不同病理痛模型大鼠調(diào)控機制的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

清潔級SD大鼠，購自上海斯萊克公司，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。實驗過程中對動物的處理符合科技部2006年頒布的《有關(guān)善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。實驗動物分兩批進行。

1.1.2 試劑與儀器

1）試劑：CFA（美國Sigma，F(xiàn)5881）;兔抗大鼠P2X3多克隆抗體（美國Abcam，ab10269）;辣根過氧化物酶標記的GAPDH（美國Cell Signaling，3683S）;山羊抗兔IgG H&L（HRP）（美國Abcam，ab6721）;BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0018）;其余試劑均為國產(chǎn)分析純級。

2）儀器：Von Frey絲（美國stoelting公司）;恒溫手術(shù)臺（美國Harvard公司）;韓式穴位神經(jīng)刺激儀（聯(lián)創(chuàng)科技南京濟生醫(yī)療科技有限公司）;超聲波粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）;電泳-轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;全能臺式高速冷凍離心機（美國Thermo Scientific公司）;Spectra Max M4酶標儀（美國美谷分子有限公司）;Image Quant LAS4000型凝膠成像系統(tǒng)（德國GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 分組

第一批：100 Hz電針對CFA大鼠脊髓P2X3表達的影響，完全隨機分為空白組、CFA組、100 Hz組和假電針組;第二批：2 Hz電針對CFA大鼠脊髓P2X3表達的影響，完全隨機分為假SNI組、SNI組、2 Hz組和假電針組。

1.2.1.2 模型制備

炎性痛模型制備：通過左側(cè)足底皮下注射完全弗氏佐劑建立炎性痛模型。

坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型制備：通過結(jié)扎并切斷左側(cè)腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)后遠端，保留腓腸神經(jīng)的方法建立神經(jīng)病理痛模型。

1.2.2 干預(yù)方法

電針組：于造模后1 d檢測完行為學(xué)介入電針干預(yù)。用0.18 mm×13 mm毫針刺入雙側(cè)“足三里”“昆侖”穴，韓式電針儀器連接，干預(yù)參數(shù)：100 Hz或2 Hz，強度先0.5 mA，每10 min增加0.5 mA，共干預(yù)30 min，1次/d。

假電針組：與電針組選取相同的穴位，僅刺入皮下，接電針，不開通電源。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 機械縮足閾

采用up and down方法檢測機械縮足閾[7]。Von frey絲0.4 g、0.6 g、1.0 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、15.0 g、26 g。從4.0 g開始，將von-Frey絲垂直刺向大鼠左側(cè)大鼠足底中央（炎性痛）或足底外側(cè)（神經(jīng)病理痛），完成S形，持續(xù)6～8 s。若大鼠出現(xiàn)縮足或添足等反應(yīng)時為陽性，記X，換鄰近的大一號von-frey絲刺激;反之記O，換鄰近的小一號von-frey絲刺激。當出現(xiàn)第一個OX或XO時，再測量4次。以（10[Xf+]）/10 000的公式計算機械縮足閾。其中為0.231，Xf為最后一根von-frey絲的對數(shù)值，為OX序列查表得出。

1.2.3.2 免疫印跡法檢測患側(cè)脊髓背角P2X3蛋白的表達

實驗大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，生理研究經(jīng)心臟灌注直至流出液體為澄清液體，快速取出患側(cè)L4～6脊髓背角，-80 ℃保存?zhèn)溆谩８鹘M脊髓背角組織加入預(yù)冷的RIPA裂解液混合液（包括蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等），冰浴超聲粉碎，靜置0.5 h后離心取上清液測量蛋白濃度。15 g上樣量用10%SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠電泳。電泳后半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫孵育，兔抗大鼠P2X3和兔抗大鼠GAPDH孵育，HRP標記的二抗孵育，ECL反應(yīng)5 min，ImageQuant LAS4000凝膠成像拍片，Image Quant TL軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)標準誤，以SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理。采用單因素方差分析;組間兩兩比較，方差齊性時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett′s T3檢驗;均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 100 Hz電針干預(yù)對炎性痛大鼠機械縮足閾的影響

結(jié)果如圖1所示，造模前，各組大鼠基礎(chǔ)機械縮足閾無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性（P>0.05）。造模后24 h，電針干預(yù)前，CFA組、100 Hz組和假電針組大鼠患側(cè)機械縮足閾顯著下降（P<0.01）。100 Hz電針干預(yù)1次和3次均能顯著提高大鼠患側(cè)機械縮足閾（P<0.01），假電針無此作用（P>0.05）。

2.2 2 Hz電針干預(yù)對坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷大鼠機械縮足閾的影響

結(jié)果如圖2所示，造模前，各組大鼠基礎(chǔ)機械縮足閾無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性（P>0.05）。造模后24 h，電針干預(yù)前，SNI組、2 Hz組和假電針組大鼠患側(cè)機械縮足閾顯著下降（P<0.01）。2 Hz電針干預(yù)1次和3次均能顯著提高大鼠患側(cè)機械縮足閾（P<0.01），假電針無此作用（P>0.05）。

2.3 100 Hz電針干預(yù)對慢性炎性痛大鼠脊髓背角P2X3蛋白表達的影響

結(jié)果如圖3所示，與空白組大鼠比較，CFA組大鼠患側(cè)脊髓背角P2X3蛋白表達明顯增多（P<0.01）。與CFA組大鼠比較，100 Hz電針組大鼠患側(cè)脊髓背角P2X3蛋白表達顯著減少（P<0.01），假電針組大鼠患側(cè)脊髓背角P2X3蛋白表達無明顯變化（P>0.05）。

2.4 2 Hz電針干預(yù)對坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷大鼠脊髓背角P2X3表達的影響

結(jié)果如圖4所示，與假SNI組大鼠比較，SNI組大鼠患側(cè)脊髓背角P2X3蛋白表達明顯增多（P<0.01）。與SNI組大鼠比較，2 Hz和100 Hz電針組大鼠患側(cè)脊髓背角P2X3蛋白表達顯著減少（P<0.01），假電針組大鼠患側(cè)脊髓背角P2X3蛋白表達無明顯變化（P>0.05）。

3 討論

慢性疼痛包括慢性炎性痛和神經(jīng)病理痛。足底皮下注射完全弗氏佐劑建立的慢性炎性痛模型具有操作簡單、模型穩(wěn)定、機械痛和熱痛下降明顯、持續(xù)時間較長的特點，常用于慢性炎性疼痛的機制及干預(yù)研究[8]。坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型（SNI）是比較新的神經(jīng)病理痛模型，具有機械痛下降、熱痛不變、持續(xù)時間長、可重復(fù)性高的特點[9]。本次實驗中我們采用的是完全弗氏佐劑模型和SNI模型進行研究。

電針對慢性炎性痛和神經(jīng)病理痛均具有良好的鎮(zhèn)痛作用。頻率是電針刺激的重要參數(shù)之一，不同頻率可通過調(diào)節(jié)不同物質(zhì)從而發(fā)揮不同的干預(yù)效應(yīng)[10]。韓濟生院士等認為低頻電針干預(yù)可促進中樞內(nèi)啡肽、腦啡肽、內(nèi)嗎啡肽釋放增加，高頻電針干預(yù)可促進強啡肽釋放[11]。不同頻率對不同疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)不同;在神經(jīng)病理痛中，周杰等采用不同頻率電針對脊神經(jīng)結(jié)扎模型大鼠進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)病理痛早期，100 Hz電針的鎮(zhèn)痛療效較2 Hz佳，在神經(jīng)病理痛慢性，2 Hz電針的鎮(zhèn)痛療效較100 Hz佳[5]。侯麗萍等通過建立坐骨神經(jīng)壓迫損傷大鼠模型，采用2 Hz和100 Hz進行干預(yù)，觀察到2 Hz和100 Hz電針干預(yù)均能顯著減輕神經(jīng)病理痛大鼠熱痛和機械痛[12]。亦有研究報道，在L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎模型中，2 Hz和100 Hz電針干預(yù)均能改善疼痛，但2 Hz鎮(zhèn)痛效應(yīng)強于100 Hz[13];在慢性炎性痛中，蔣袁絮等[14]認為，在弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性痛中，不論在緩解關(guān)節(jié)腫脹還是緩解疼痛，100 Hz電針干預(yù)作用均優(yōu)于2 Hz。項璇兒等[15]研究報道，2 Hz、100 Hz、2/100 Hz均能提升弗氏完全佐劑誘導(dǎo)大鼠的機械痛閾和熱痛閾。我們本次研究中，分別用100 Hz電針和2 Hz電針對弗氏佐劑大鼠和坐骨神經(jīng)分離損傷大鼠進行干預(yù)，觀察到，100 Hz電針可減輕炎性痛、2 Hz電針可減少神經(jīng)病理痛。

P2X3高度表達于背根神經(jīng)節(jié)，與疼痛的形成和發(fā)展密切相關(guān)。近年來，研究人員觀察到，脊髓背角的P2X3高表達與神經(jīng)病理痛的形成有關(guān)，如王玉潔[16]等研究報道，坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠脊髓背角P2X3陽性細胞表達增多。王金金等[2]亦觀察到相似的結(jié)果。趙文宇等等[17]發(fā)現(xiàn)，在坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠中，脊髓背角P2X3mRNA表達增多。本次研究中，我們觀察到不論是完全弗氏佐劑大鼠還是坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷大鼠，脊髓背角P2X3蛋白表達均增多。

大量研究報道，電針鎮(zhèn)痛機制，除了促進中樞阿片肽釋放外，還可能有其他機制[20-21]。本次研究中，我們觀察到，100 Hz電針可顯著降低完全弗氏佐劑誘導(dǎo)大鼠脊髓背角P2X3蛋白表達，2 Hz電針可明顯減少坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷大鼠脊髓背角P2X3蛋白表達。因此，我們認為，電針可有效干預(yù)慢性炎性痛和神經(jīng)病理痛，其鎮(zhèn)痛作用可能與下調(diào)脊髓背角P2X3蛋白表達相關(guān)。

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（2019-05-10收稿 責任編輯：徐穎）