乙酰基-11-酮-β-乳香酸對大鼠關節軟骨細胞體外培養的作用

何明為 姚軍 韋慶軍

摘要：目的：觀察乙酰基-11-酮-β-乳香酸（AKBA）對大鼠關節軟骨細胞增殖和表型維持的影響。方法：取3天齡的SD乳鼠的軟骨細胞進行體外培養。利用MTT法檢測AKBA對細胞的毒性作用;設置空白組和低、中和高濃度AKBA藥物組;番紅O觀察AKBA對軟骨細胞分泌糖胺聚糖（GAG）的影響;qRT-PCR分析AKBA干預對軟骨特異性基因表達的影響。結果：低、中和高濃度AKBA組對細胞增殖、軟骨特異性基因相對表達量均明顯高于空白組（P均<0.05），尤以中濃度組促進作用最顯著。結論：AKBA具有促進軟骨細胞增殖的作用，可作為潛在的治療骨關節炎的藥物。

關鍵詞：乙酰基-11-酮-β-乳香酸;骨關節炎;關節軟骨;增殖

【中圖分類號】R-3 ???【文獻標識碼】A ???【文章編號】2107-2306（2019）06-015-02

乙酰基-11-酮-β-乳香酸（Acetyl-11-keto-β-boswellic acid， AKBA）是一種從乳香樹膠樹脂中提取出的有效活性化合物。有研究表明，作為一種藥物化合物，AKBA曾被用于治療炎癥[1]、潰瘍[2]和癌癥[3]等疾病;AKBA還可改善膝關節骨性關節炎（osteoarthritis， OA）患者疼痛、僵硬和功能[4]。然而，AKBA對OA的作用機制尚不清楚。基于AKBA對軟骨細胞具有保護及促進增殖作用的假設，本研究旨在探討AKBA對軟骨細胞增殖和軟骨特異性基因表達的影響，為研究AKBA對OA的治療作用提供實驗依據。

1材料與統計方法

1.1 材料

藥物購于MedChenExpress （MCE）公司（https：//www.medchemexpress.cn/AKBA.html），其化學結構如圖1A所示。主要試劑：DMEM培養基（高糖）、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、MTT細胞毒性試劑盒和番紅O染色試劑盒購于北京索來寶科技有限公司，RT-PCR試劑盒購于上海吉凱生物科技有限公司，胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。

1.2 統計方法

采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計處理。數據以（`x ± s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。

2方法與結果

2.1 AKBA對SD乳鼠關節軟骨細胞增殖作用的影響

為檢測AKBA對SD乳鼠關節軟骨細胞增殖作用的影響，取出生3日齡的乳鼠原代軟骨細胞進行培養至第三代。將軟骨細胞接種于96孔板，每孔5000個細胞，置于恒溫培養箱中過夜。第二天加入含有不同濃度AKBA的培養基，分別干預3天。之后向每孔培養基中加入20μL的MTT，繼續在恒溫箱中孵育4小時后將多余培養基吸走，加入200μL DMSO并在黑暗條件下孵育15分鐘。最后用Multiskan GO微板分光光度計在570nm處測定光密度值。如圖1B所示，AKBA在小于40μM 時對軟骨細胞增殖具有促進作用，尤其在6.25 μM時，促細胞增殖作用達到最高。

2.2細胞爬片染色

為觀察AKBA作用于軟骨細胞后的細胞外基質糖胺聚糖（GAG）的分泌情況，我們對細胞生長爬片進行了番紅O染色。將第三代軟骨細胞接種于鋪有細胞爬片的24孔板中，每孔10000個細胞，置于恒溫培養箱中過夜后，棄去培養液及未貼壁的細胞，將每塊孔板隨機分為4組（空白對照組、低濃度組（1.5 μM）、中濃度組（6.25 μM）和高濃度組（25 μM）），每組6個孔，共24孔。待藥物干預滿三天后終止培養，用4%多聚甲醛溶液固定細胞爬片30分鐘，之后進行按照染色試劑盒上的說明書進行操作。染色結果如圖2所示，在AKBA干預3天后，中濃度（6.25 μM）組的細胞數量最多，同時紅染面積也越大。表明AKBA能促進軟骨細胞分泌GAG，對有體外二維培養的軟骨細胞的增殖有促進作用。

2.3 AKBA對軟骨細胞特異性基因表達的影響

為分析AKBA對軟骨細胞特異性基因的影響。將第三代軟骨細胞接種于6孔板中，置于恒溫培養箱中過夜后，分別加入含有低（1.5 μM）、中（6.25 μM）和高（25 μM）濃度的AKBA培養基，繼續干預3天。隨后采用RT-PCR檢測軟骨細胞II型膠原（）和聚蛋白多糖（）的mRNA擴增水平，并通過分析比較各個基因的表達情況。本研究所用引物如下：（上游：GTCCTACAATGTCAGGGCCA;下游：ACCCCTCTCTCCCTTGTCAC）;（上游：GAATGGGAGCCAGCCTACAC;下游：GAGAGGCAGAGGGACTTTCG）;（上游：TCCAGTATGACTCTACCCACG;下游：CACGACATACTCAGCACCAG）。實驗結果如圖3顯示，加入AKBA后軟骨特異性基因和明顯都得到上調（p<0.05），尤其是中濃度（6.25 μM）組上調效果最明顯。

3討論

據了解，OA是關節炎中最常見的一種類型，已被認為是影響全世界數十億人的疾病之一，其特點是關節軟骨慢性退行性變，關節疼痛，關節功能紊亂等[5]。關節軟骨作為一種再生能力較差的組織，在疾病、衰老或創傷的影響下，容易在結構上發生破壞或退化，從而導致OA的發生發展。在OA進展過程中，包括促炎因子（如MMP13、IL6和ADAMTS4等）在內的分解代謝因子被激活，誘導軟骨逐漸自我破壞，影響了軟骨細胞外基質（ECM）的合成和分泌，進而加深加快OA的嚴重程度[6]。因此，發掘具有軟骨保護作用和維持軟骨細胞功能的藥物能為OA的治療提供新的思路。

AKBA，是乳香酸類植物的主要成分，具有多種生物學活性，包括抗炎、抗病毒、抗癌作用等。以往有研究報道，AKBA可改善OA患者疼痛、僵硬和功能，然而，其作用機制尚不清楚。在本研究中，我們通過觀察關節軟骨細胞增殖和表型維持來檢測AKBA的作用。該研究發現，經AKBA干預3天后，低、中、高濃度的三組AKBA均對關節軟骨細胞的增殖能力的產生促進作用;通過評估番紅O染色發現，AKBA在維持軟骨細胞外基質分泌GAG方面有明顯的效果，尤其在6.25 μM時促進細胞增殖的作用最顯著。有研究表明，在軟骨細胞去分化后，和的表達會減少[7]，而本研究通過qRT-PCR發現，AKBA治療后和表達不減反升，提示AKBA可能具有抑制軟骨細胞的去分化的作用。

綜上所述，本研究證實AKBA對大鼠關節軟骨細胞增殖和功能方面有積極作用。結果提示AKBA可促進大鼠關節軟骨細胞的增殖和維持其表型，可能成為治療OA軟骨損傷的潛在治療藥物。

參考文獻：

[1]Banno， N.， et al.， Anti-inflammatory activities of the triterpene acids from the resin of Boswellia carteri. J Ethnopharmacol， 2006. 107（2）： p. 249-53.

[2]王文芳， et al.，乳香酸藥理活性研究進展.生命的化學，2015. 35（4）： p. 537-542.

[3]Wang， F.， et al.， Two new triterpenoids from the resin of Boswellia carterii. Journal of Asian Natural Products Research， 2011. 13（3）： p. 193-197.

[4]乳香-姜黃素制劑治療膝骨關節炎的臨床評價.國外醫藥（植物藥分冊），2005，20（1）：34-35.

[5]Chen， Y.， et al.， Association between bisphosphonate use and risk of undergoing knee replacement in patients with osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases， 2018. 78（2）： p. annrheumdis-2018-212998.

[6]Luo， L.， et al.， Protocatechuic acid benefits proliferation and phenotypic maintenance of rabbit articular chondrocytes： An in？？？vitro study. Experimental & Therapeutic Medicine.

[7]Huang， X.， et al.， Protective effects of baicalin on rabbit articular chondrocytes in vitro. Exp Ther Med， 2017. 13（4）： p. 1267-1274.

基金項目：廣西研究生教育創新計劃項目（YCSW2019109）