精制益母草生物堿提取純化工藝研究Δ

鄭師明，嚴鵬科，李世煌，段才聞，吳仲洪，肖國宏#

（1.廣州醫學院第三附屬醫院，廣州市 510150；2.湖南郴州市第四人民醫院心內科，郴州市 423000；3.南華大學藥物藥理研究所，衡陽市 421001）

益母草，《神農本草經》原名茺蔚，為唇形科益母草屬植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的全草，我國大部分地區都有分布，具有來源廣、易得到、常規劑量無毒副作用的特點。現代藥理研究發現，益母草具有擴張冠脈、增加冠脈血流、溶栓、抗凝、降脂、降血黏度、降低紅細胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循環、抗氧自由基、減少細胞內鈣超載、興奮子宮、利尿等諸多作用，從而為其用于臨床提供了廣泛的藥理學基礎[1]。

市售益母草注射液，由于提取工藝和純度等不足，目前國家只批準用于肌肉注射并用于產后出血。近年有初步研究報道，其可用于心肌缺血的防治，且療效確切[1]。由于心肌缺血引起的心血管疾病具有發病快、病情急、危害嚴重等特點，靜脈注射能較快控制病情，患者易于接受。因此，對可用于靜脈注射的精制益母草生物堿的生產工藝有必要作進一步研究。

1 材料

1.1 儀器

石英回流裝置（上海精密科學儀器有限公司）；超聲提取器（深圳市科工達超聲設備有限公司）；SHB2B95型循環真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；旋轉蒸發儀（上海博通化學科技有限公司）。

1.2 試藥

益母草粗粉（產地安徽）經湖南九芝堂藥店鑒定并加工為飲片；水蘇堿標準品（陜西森弗生物技術有限公司，批號：20080307，含量：＞99%）；水蘇堿標準品ADS-A、ADS-B、ADS-C、ADS-D型制藥用級特制品大孔樹脂（南開合成科技有限公司）；雷氏鹽、無水乙醇、鹽酸、丙酮、鹽酸乙醇等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 超聲提取法

2.1.1 70%乙醇結合超聲提取：稱取100 g益母草粗粉，置于3000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量體積的70%乙醇，振搖使充分混勻，先浸泡30 min，再超聲40 min，過濾，濾液置旋轉蒸發儀減壓蒸餾（溫度為75℃）至體積為100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，備用。

2.1.2 95%乙醇結合超聲提取：稱取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量體積的95%乙醇，振搖使充分混勻，先浸泡30 min，再超聲40 min，過濾，濾液置旋轉蒸發儀減壓蒸餾（溫度為75℃）至體積為100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，備用。

2.1.3 0.05%鹽酸乙醇超聲提取：加入0.05%鹽酸乙醇，提取方法同“2.1.2”項。

2.2 回流提取法

2.2.1 70%乙醇結合回流提取：稱取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量體積的70%乙醇，振搖使充分混勻，先浸泡10 min，再加熱至70～80℃回流2 h，過濾，濾液置旋轉蒸發儀減壓蒸餾（溫度為75℃）至體積為100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，備用。

2.2.2 95%乙醇結合回流提取：稱取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量體積的95%乙醇，振搖使充分混勻，先浸泡10 min，再加熱至70～80℃回流2 h，過濾，濾液置旋轉蒸發儀減壓蒸餾（溫度為75℃）至體積為100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，備用。

2.2.3 0.05%鹽酸乙醇回流提取：加入0.05%鹽酸乙酸，提取方法同“2.2.2”項。

2.3 浸漬提取法

2.3.1 1%鹽酸浸漬法：取100 g益母草粗粉，用8倍體積的1%鹽酸（約3000 mL）在室溫（20℃）浸泡24 h，過濾后將濾液置于旋轉蒸發儀中減壓蒸餾（80℃），濃縮至1 mL相當于原藥1 g即可（約100 mL），備用。

2.3.2 1%磷酸浸漬法：取100 g益母草粗粉，用8倍體積的1%磷酸（約3000 mL）在室溫（20℃）浸泡24 h，過濾后將濾液置于旋轉蒸發儀中減壓蒸餾（80℃），濃縮至1 mL相當于原藥1 g即可（約100 mL），備用。

2.4 生物堿的離子交換法純化

2.4.1 樹脂最大吸附量的確定：分別取1 g樹脂加入25 mL 1.72 mg·mL-1的提取液中，調pH值分別至6、7、8，25 ℃恒溫振蕩，2 h后定量吸取溶液，過濾沉淀，計算各種上清液中生物堿含量，上樣量與此值的差為理論吸附量或樹脂的靜態吸附容量。

2.4.2 樣品純化：取最佳優化工藝的提取液，調定pH值，過柱并吸附飽和的大孔樹脂，去離子水洗至中性，10%、30%、50%、70%、90%乙醇依次洗脫，收集每一洗脫液，生物堿沉淀，薄層層析判斷有效成分。有效洗脫成分減壓濃縮，濃縮液以NaOH調pH至不產生沉淀為止。靜置過夜，離心沉淀物，去離子水洗至中性，干燥，無水乙醇溶解，過濾，減壓濾液濃縮，真空干燥。

2.4.3 檢測：以丙酮為空白，在最大波長510 nm處測各樣本的吸光度（A），再代入公式中計算生物堿的含量（W＝179.63×10×A/106.5）。水蘇堿標準品用于檢測該方法的準確度。此試驗制備了3個不同濃度的樣品分別測定3次，結果回收率為100.6%，表明該方法的準確度達到要求。

2.4.4 干膏質量的測定：將樣品液過濾，精確定容至100 mL，置烘箱中干燥為粉末，稱重。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 精制益母草生物堿提取工藝的篩選

3.1.1 不同溶劑超聲提取對精制益母草生物堿提取率的影響：通過3次對不同批號（20080403、20060504、20060507）藥物原料的提取研究發現，超聲結合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中70%乙醇的平均生物堿提取率為0.22%，95%乙醇的提取率為0.29%，0.05%鹽酸乙醇的提取率為0.373%。結果表明，在超聲法中以0.05%鹽酸乙醇提取的干膏生物堿含量和提取率最高。

3.1.2 不同溶劑回流提取對精制益母草生物堿提取率的影響：通過3次對不同批號藥物原料的提取研究發現，回流法結合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中70%乙醇的平均生物堿提取率為0.217%，95%乙醇的提取率為0.303%，0.05%鹽酸乙醇的提取率為0.317%。結果表明，在回流法中以0.05%鹽酸乙醇提取的干膏生物堿含量和提取率最高。

3.1.3 不同溶劑冷浸提取對精制益母草生物堿提取率的影響：通過3次對不同批號藥物原料的提取研究發現，冷浸法結合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中1%鹽酸的平均生物堿提取率為0.410%，1%磷酸的提取率為0.340%。結果表明，在浸漬法中以1%鹽酸提取的干膏生物堿含量和提取率最高。

3.2 正交設計優化精制益母草生物堿提取工藝

3.2.1 超聲提取法正交設計優化：結合實際情況，做L9（34）正交試驗，考慮溶劑濃度、溶劑用量、處理時間、處理次數4個因素，每個因素取3個水平，設計正交表，用雷氏鹽沉淀溶解比色法測定總生物堿含量。結果表明，超聲提取法最佳提取工藝為溶劑濃度1%，溶劑量8倍，處理60 min，處理1次（具體試驗另文發表）。

3.2.2 回流提取法正交設計優化：考慮溶劑濃度、溶劑用量、處理時間、處理次數4個因素，每個因素取3個水平，設計正交表，用雷氏鹽沉淀溶解比色法測定總生物堿含量。結果表明，回流提取法最佳提取工藝為溶劑濃度1.5%，溶劑量4倍，處理60 min，處理3次（具體試驗另文發表）。

3.2.3 浸漬提取法正交設計優化：考慮溶劑濃度、溶劑用量、處理時間、處理次數4個因素，每個因素取3個水平，設計正交表，用雷氏鹽沉淀溶解比色法測定總生物堿含量。結果表明，浸漬提取法最佳提取工藝為溶劑濃度1%，溶劑量8倍，處理24 h，處理3次（具體試驗另文發表）。

3.3 精制益母草生物堿純化工藝及其優化

3.3.1 不同ADS大孔樹脂對精制益母草生物堿的靜態吸附作用：在提取液的pH為6～8之間時，4種ADS大孔樹脂對生物堿均有吸附作用。其中，pH值為8時ADS-B的靜態吸附最強。研究過程中觀察到，當提取液的pH值為4、5時，各種樹脂的靜態吸附很少；pH值為9、10、11時，提取液出現沉淀反應，影響過柱效果。不同ADS型號樹脂、pH值對精制益母草生物堿靜態吸附作用的影響見表1。

表1 不同ADS型號樹脂、pH值對精制益母草生物堿靜態吸附作用的影響Tab 1 Effect of different ADS macroporous resin and pH on static absorbability of alkaloid of L.japonicus

3.3.2 不同ADS大孔樹脂對精制益母草生物堿的純化作用：不同ADS柱純化精制益母草生物堿的回收效率不同，ADS-C回收生物堿的量最高（以水蘇堿含量為判斷指標），但回收物干膏的生物堿含量僅為2.8%；ADS-B回收生物堿的量略低于ADS-C，但回收物干膏的生物堿（以水蘇堿含量為判斷指標）含量已達38.6%，符合國家中藥新藥技術要求：所測定成分的總含量應不低于總固體量的20%（靜脈用不少于25%）。不同ADS型號樹脂對精制益母草生物堿純化作用的影響見表2。

4 討論

益母草的主要化學成分有生物堿類、二萜類、黃酮類、揮發油類、微量元素等[1]，其中生物堿類一直被認為是益母草的有效成分，用作質量控制的指標。生物堿類主要包括益母草堿、水蘇堿、益母草啶等。本研究中筆者提取出的精制益母草生物堿，與常規提取的益母草生物堿比較有更強的抗心肌缺血作用，且無明顯毒副作用（結果另文發表）。

表2 不同ADS型號樹脂對精制益母草生物堿純化作用的影響Tab 2 Effect of different ADS macroporous resin on purification of alkaloid of L.japonicus

目前臨床應用的益母草制劑的提取工藝一直都采用水提醇沉、濃縮干燥的方法，有效成分得率低，含雜質較多，制約了將其進一步制成現代化的劑型。因此，研制新型益母草制劑首先需加強益母草提取精制工藝研究。

超聲提取法是一種簡便、不需加熱、提取時間短的現代中藥提取方法[2]，適用于固體制劑中測定組分的提取，應用日益廣泛。研究發現，超聲結合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中溶劑A的平均生物堿提取率為0.220%，溶劑B的提取率為0.290%，溶劑C的提取率為0.373%。在超聲法中，以溶劑C的提取干膏生物堿含量和提取率最高。

回流提取法克服了一般的冷浸、煎煮等法因提取時間長影響提取率的缺點，利用有機溶劑的相似相溶原理，用不同濃度的溶劑進行回流提取，再用雷氏鹽比色法進行測定，用光譜法測量益母草提取液中的總堿量，從而探討不同溶劑、不同濃度和不同提取時間對益母草總堿提取率的影響。研究發現，回流法結合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中溶劑A的平均生物堿提取率為0.217%，溶劑B的提取率為0.303%，溶劑C的提取率為0.317%。

浸漬提取法一般是在常溫下進行，對熱敏性的物質的提取很有利，但所需時間長，尤其是水作溶劑時易發霉變質。在傳統的酸提法中加入95%的乙醇可增加其提取效率，縮短時間。本研究即對以酸及醇為溶劑的方法進行了初步的探索。研究發現，浸漬法結合不同溶劑提取對精制益母草生物堿提取率的影響不同，其中溶劑A的平均生物堿提取率為0.410%，溶劑B的提取率為0.340%。

大孔樹脂吸附技術是20世紀70年代發展起來的一種新工藝，是將中草藥提取液通過大孔樹脂，吸附其中的有效成分，再經洗脫回收，除掉雜質的一種純化精制方法[3～5]。該技術目前已較廣泛應用于中藥新藥的開發和中成藥的生產中，主要用于分離和提純過程。筆者選用了南開大學的藥用級ADS-A、ADS-B、ADS-C、ADS-D 4種樹脂進行比較研究，發現在提取液的pH值為6～8之間時，4種ADS大孔樹脂對生物堿均有吸附作用，其中pH值為8時ADS-B的靜態吸附最強。

[1]阮金蘭，杜俊蓉，曾慶忠，等.益母草的化學、藥理和臨床研究進展[J].中草藥（增刊），2003，34（11）：15.

[2]張 穎，鞏學勇，冀海偉，等.翻白草中槲皮素的提取工藝優化及含量測定[J].中國藥房，2008，19（30）：2345.

[3]史作清，施榮富，王春紅，等.樹脂吸附法在中草藥有效成分提取中的應用[J].中草藥，2001，32（7）：660.

[4]何 琦，丁立生.大孔吸附樹脂銀杏黃酮提取純化性能研究[J].天然藥物研究與開發，2000，13（1）：56.

[5]馬振山.大孔樹脂吸附在藥學領域中的研究應用[J].中成藥，1997，19（12）：40.