牛初乳安全性的毒理學(xué)研究

趙金鵬 韓超 石麗麗 李巖

摘?要：目的：評(píng)價(jià)牛初乳的安全性。方法：按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)和大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)等毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)。結(jié)果：牛初乳大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)中MTD值>15.0g/kg·BW。小鼠骨髓微核試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、小鼠精子致畸試驗(yàn)對(duì)牛初乳樣品沒(méi)有致突變的作用。大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)也均未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)：對(duì)照組和各劑量組大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育均未見(jiàn)異常，血液學(xué)、血液生化、主要臟器重量、臟器系數(shù)均在正常值范圍內(nèi)，組織病理學(xué)檢查未見(jiàn)與受試物有關(guān)的異常改變。結(jié)論：牛初乳屬于無(wú)毒級(jí)、不會(huì)引起突變，大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)也均未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：牛初乳;安全性評(píng)價(jià);毒理學(xué);30d喂養(yǎng)

牛初乳凍干粉是以母牛分娩3d內(nèi)的初乳采用冷凍干燥工藝制成的一種具有多種保健功能的乳品，富含蛋白質(zhì)及多種免疫球蛋白、生長(zhǎng)因子、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等，營(yíng)養(yǎng)成分比較均衡，并且內(nèi)含多種生物活性物質(zhì)和功能因子。現(xiàn)代藥理學(xué)和動(dòng)物功能學(xué)研究表明，牛初乳凍干粉具有顯著提高免疫功能、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、抗衰老的多種保健功能[1-3]。最近利用牛初乳研究預(yù)防CCl4化學(xué)性肝損傷取得良好的效果[4]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，牛初乳凍干粉具有預(yù)防酒精肝損傷的效果[5]，且對(duì)睡眠狀況具有一定的改善作用[6]。為評(píng)價(jià)牛初乳的安全性，本研究對(duì)牛初乳樣品進(jìn)行了急毒試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)，為其安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?材料

1.1.1?受試物?牛初乳，某醫(yī)藥科技有限公司提供，內(nèi)容物為淡黃色至黃色粉末，人體推薦量為0.8g/d。

1.1.2?動(dòng)物?KM小鼠（SPF級(jí)）、SD大鼠（SPF級(jí)），生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2012—0004，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室為屏障環(huán)境，溫度20～24℃，相對(duì)濕度40 %～70 %，許可證號(hào)：SYXK（京）2014—0043。

1.1.3?主要儀器設(shè)備?血細(xì)胞自動(dòng)分析儀（sysmex XT-1800i）、全自動(dòng)生化分析儀（日立7080）。

1.2?方法

1.2.1?大鼠急性毒性試驗(yàn)?按照最大耐受量法進(jìn)行。選用SD大鼠20只，雌雄各半，體重為180～220g。受試物用蒸餾水配成濃度為0.25g/mL的溶液。以20.0mL/kg·BW量進(jìn)行灌胃，1日3次，每次間隔4h，受試物給予劑量為15g/kg·BW。給予牛初乳樣品后持續(xù)觀察14d，記錄大鼠有無(wú)死亡和中毒表現(xiàn)。

1.2.2?Ames試驗(yàn)?采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法。設(shè)未處理對(duì)照、溶劑對(duì)照組（蒸餾水）、陽(yáng)性對(duì)照組（陽(yáng)性物2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、1，8-二羥基蒽醌，敵克松）。設(shè)5 個(gè)劑量組分別為牛初乳5 000、1 000、200、40、8μg /皿。每種菌（TA97、TA98、TA100、TA102）每個(gè)測(cè)試濃度設(shè)3 個(gè)平皿，實(shí)驗(yàn)條件是加與不加S-9，并且再同樣重復(fù)1 次，計(jì)回變菌落數(shù)。如牛初乳樣品的回變菌落數(shù)大于對(duì)照組的2倍并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判為牛初乳樣品遺傳毒性試驗(yàn)為陽(yáng)性。

1.2.3?小鼠微核試驗(yàn)?采用間隔1d 2次對(duì)小鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃法進(jìn)行試驗(yàn)。雌雄各25 只小鼠，體重25～30g，隨機(jī)分為5 組，實(shí)驗(yàn)采用最大灌胃劑量方法一次性進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)，牛初乳樣品劑量分別為5.00、2.50、1.25g/kg·BW，另設(shè)蒸餾水為陰性對(duì)照組、環(huán)磷酰胺40mg/kg·BW為陽(yáng)性對(duì)照組。按照20.0 mL /kg·BW灌胃，最后一次給樣后6h處死動(dòng)物，將其胸骨骨髓取下進(jìn)行制片。顯微鏡下計(jì)數(shù)每鼠1 000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE），記錄含有微核的細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)微核發(fā)生率;每只小鼠為200 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算成熟紅細(xì)胞比值（PCE /NBC）與嗜多染紅細(xì)胞。

1.2.4?小鼠精子致畸試驗(yàn)?雄性小鼠25只，體重為25～35g，隨機(jī)分為5 組，實(shí)驗(yàn)按照一次性最大灌胃劑量方法進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)，設(shè)蒸餾水為陰性對(duì)照組、環(huán)磷酰胺40.0mg/kg·BW為陽(yáng)性對(duì)照組，受試物劑量分別為5.00、2.50、1.25g/kg·BW。按照20.0mL /kg·BW進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)5d。在最后一次給樣后的第30天處死小鼠，將兩側(cè)附睪取下后進(jìn)行常規(guī)制片、鏡檢。對(duì)每只小鼠結(jié)構(gòu)完整的1 000個(gè)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算精子畸形率并記錄畸變數(shù)目。

1.2.5?大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)?斷乳SD大鼠雌雄各40只，隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組（蒸餾水），牛初乳0.33、0.67、1.34g/kg·BW 組，劑量分別相當(dāng)于人體推薦攝入量的25 、50 、100 倍。按照大鼠每日100g體重進(jìn)食10g飼料計(jì)算，低、中、高劑量組分別將0.066、0.134、0.268kg的受試物添加至20kg鼠維持飼料中，為消除因添加受試物而導(dǎo)致的各組飼料蛋白質(zhì)含量的差異，分別將188、142、94g純度為85%的酪蛋白添加入對(duì)照組、低劑量組和中劑量組，以使各組飼料蛋白質(zhì)含量相同。大鼠自由進(jìn)食、飲水。每周記錄體重、進(jìn)食量并計(jì)算食物利用率。30d后麻醉腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)血液學(xué)檢查，包括血紅蛋白（HGB）含量、紅細(xì)胞（RBC）和白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)及分類、。血清分離后進(jìn)行生化檢查，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU）、總膽固醇（CHO）、肌酐（CREA）含量。取每只大鼠的睪丸或卵巢、肝、腎、脾進(jìn)行稱重，計(jì)算臟體比并進(jìn)行臟器初步觀察，取高劑量組和對(duì)照組的卵巢睪丸、胃、肝、十二指腸、腎、脾對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)的檢查。

1.2.6?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用泊松分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析微核試驗(yàn)的結(jié)果，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析小鼠精子畸形試驗(yàn)的結(jié)果，先對(duì)30d喂養(yǎng)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性的檢驗(yàn)，若各組方差性均齊，則采用單因素方差分析法進(jìn)行總體比較，以α=0.05作為顯著性水平，若方差不齊則要調(diào)整變量轉(zhuǎn)換原始數(shù)據(jù)，方差齊性檢驗(yàn)合格后，選用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若方差齊性不能滿足，采用其他的統(tǒng)計(jì)方法如Brown-Forsythe檢驗(yàn)或Welch檢驗(yàn)等。

2?結(jié)果與分析

2.1?大鼠急性毒性試驗(yàn)

大鼠在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)死亡情況、中毒癥狀，牛初乳急性經(jīng)口大鼠試驗(yàn)MTD>15.0g/kg·BW（表1），級(jí)別為無(wú)毒。

2.2?遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1?Ames試驗(yàn)?在加與不加S-9的情況下，以8、40、200、1 000、5 000μg/皿的劑量在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)做2次試驗(yàn)，2次試驗(yàn)中受試物對(duì)照組、高中低劑量組均無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，回變菌落數(shù)未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍（表2）。因此，在S-9的加與不加時(shí)，不曾見(jiàn)牛初乳對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的4株試驗(yàn)菌株有致突變作用。

2.2.2?小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)?受試物高中低劑量組PCE與成熟紅細(xì)胞的比例不少于陰性對(duì)照的20%，表明牛初乳樣品在實(shí)驗(yàn)劑量下無(wú)細(xì)胞毒性;♂♀陰性對(duì)照組的微核發(fā)生率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）（表3），而牛初乳樣品高中低劑量組的陰性對(duì)照組與微核率比較均無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明該受試物不能引起小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞突變作用。

2.2.3?小鼠精子致畸試驗(yàn)?受試物對(duì)照組與高中低劑量組小鼠精子畸形率陰性相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）（表4），而陰性對(duì)照組與環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.01）（表5），說(shuō)明該受試物不能對(duì)小鼠精子產(chǎn)生畸形的作用。

2.3?大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)

2.3.1?動(dòng)物的食物利用率、成長(zhǎng)狀況?各組動(dòng)物活動(dòng)、生長(zhǎng)正常。雌性0.33g/kg·BW劑量組大鼠第3周和第4周進(jìn)食量明顯低于對(duì)照組（P<0.01），上述數(shù)據(jù)在本實(shí)驗(yàn)室歷史對(duì)照范圍內(nèi)，認(rèn)為無(wú)生物學(xué)意義。除此之外，對(duì)照組與高中低劑量組雌雄動(dòng)物體重、進(jìn)食量、食物利用率相比均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.3.2?血液學(xué)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)?雄性0.67g/kg·BW劑量組大鼠中性細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比明顯升高（P<0.01）、淋巴細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比明顯降低（P<0.01）。但在本實(shí)驗(yàn)室歷史正常對(duì)照檢測(cè)范圍內(nèi)，高中低劑量組間也無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，認(rèn)為該差異無(wú)生物學(xué)意義，其余雌、雄高中低受試物劑量組的血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（P>0.05）（表6）。雌性1.34g/kg·BW劑量組大鼠AST明顯低于對(duì)照組（P<0.01），該指標(biāo)的降低無(wú)生物學(xué)意義。雄性0.67g/kg·BW劑量組ALT明顯高于對(duì)照組（P<0.05），但在本實(shí)驗(yàn)室歷史正常對(duì)照檢測(cè)范圍內(nèi)，認(rèn)為該差異無(wú)生物學(xué)意義。其余雌雄高中低劑量組血生化指標(biāo)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（P>0.05）（表7～8）。

2.3.3?組織病理學(xué)觀察及大體解剖?大體檢查對(duì)照組和高中低實(shí)驗(yàn)計(jì)量組各臟器未見(jiàn)異常，對(duì)照組與高中低劑量組大鼠臟器重量和臟器系數(shù)相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）。有個(gè)別動(dòng)物在組織病理檢查中出現(xiàn)肝細(xì)胞灶狀樣壞死（對(duì)照組0/20例、高劑量組1/20例）、肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死（對(duì)照組1/20例、高劑量組2/20例）和腎盂擴(kuò)張（對(duì)照組1/20例、高劑量組0/20例）。上述肝臟和腎臟病理學(xué)改變是動(dòng)物自身常見(jiàn)病變，且高劑量組和與對(duì)照組無(wú)明顯差異，確定受試物與此無(wú)關(guān)。卵巢、脾、胃腸、睪丸等臟器未見(jiàn)明顯異常。綜上認(rèn)為，牛初乳未引起有意義的病理改變。

3?討論

牛初乳內(nèi)含的多種活性成分與酶類（如超氧化物歧化酶SOD）等具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、調(diào)節(jié)體內(nèi)正常代謝功能。牛初乳在本次實(shí)驗(yàn)的毒理學(xué)食物評(píng)價(jià)結(jié)果中顯示，牛初乳對(duì)♀♂大鼠急性毒性試驗(yàn)中的MTD值均>15.0g/kg·BW。急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中可以明確看出，牛初乳屬于無(wú)毒級(jí)。小鼠精子畸形試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)牛初乳有致突變作用。以0.33、1.67、1.34g/kg·BW劑量的牛初乳摻料給予大鼠30d，各組動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育良好，體重增加正常、組織病理學(xué)檢查、血生化及血液學(xué)檢查均未見(jiàn)與牛初乳樣品有關(guān)的異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，保健食品牛初乳是安全的，該實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用牛初乳提供了毒理學(xué)方面的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]汪岱迪，金衛(wèi)紅，盂群，等.活性初乳素對(duì)受孕母鼠胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J].南京師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1997，20（1）：60-64.

[2]趙巖.初乳素的免疫調(diào)節(jié)作用[J].草食家畜，2001（3）：55-57.

[3]程光宇，唐梓進(jìn)，吳京燕，等.活性初乳素對(duì)小鼠的抗衰老作用[J].南京師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1996，19（3）：69-72.

[4]江海濤，吳京燕，程光宇，等.初乳素預(yù)防化學(xué)性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33（5）：12-14.

[5]吳京燕，潘玉英，楊云峰，等.牛初乳凍干粉對(duì)酒精性肝損傷的預(yù)防作用[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（1）：33-35.

[6]江海濤，任源浩，陳勇，等.牛初乳凍干粉改善小鼠睡眠狀況的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2006，34（12）：29-30、45.

[7]胡居吾，陳俊杰，涂偉，等.乳鐵蛋白牛初乳顆粒的毒理安全性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（12）：7195-7198.

[8]孫紅梅，羅蓉，李冬梅.輔酶Q10和維生素E配伍的穩(wěn)定性和食用安全性研究[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2016，22（6）：17-20.

[9]陳雅靜.關(guān)于“食品”含義的文獻(xiàn)綜述 ——新《食品安全法》第150條探討[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2017，23（5）：17-19.

Safety Evaluation on Cow Colostrum

ZHAO Jin-peng，HAN Chao，SHI Li-li，LI Yan

（National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：ObjectiveTo evaluate the toxicology safety of cow colostrum.MethodAcute oral toxicity test，genetic toxicity test and 30 days oral toxicity test were conducted according to technical guidlines of inspection and evaluation for health food.ResultMID of acute oral toxicity test for cow colostrum was greater than 15.0g/kg·BW.No mutation effects were induced in Ames test，bone marrow cell micronucleus test in mice，and sperm abnormality test in mice.For the 30 days oral toxicity test，the parameters including growth and development，hematology，biochemistry，main organ weight and organ weight ratio were in the range of normal value，and no abnormality related to the cow colostrum was induced in the histopathology.ConclusionNo obvious toxicity was induced in cow colostrum.

Keywords：cow colostrum;safety evaluation;toxicology;30d oral toxicity test

（責(zé)任編輯?唐建敏）