養陰潤目丸對干眼模型大鼠結膜上皮細胞中Caspase-3、Caspase-6表達的影響

王超群 李點 劉慧萍 李玲

〔摘要〕 目的 研究養陰潤目丸對干眼模型大鼠結膜上皮細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6（Caspase-6）表達的影響。方法 將50只SD雄性大鼠按隨機數字法分成5組，10只/組，分別為正常組、假手術組、模型組、養陰潤目丸組、杞菊地黃丸組。模型組、養陰潤目丸組、杞菊地黃丸組3組均采用去勢法建立干眼模型。各組予以相應干預，干預30 d后，取大鼠結膜上皮組織，采用Tunel法檢測Caspase-3、Caspase-6的陽性表達率。結果 養陰潤目丸組和杞菊地黃丸組結膜上皮細胞中Caspase-3、Caspase-6的陽性表達明顯低于模型組（P<0.05）。結論 養陰潤目丸對干眼的作用機制可能是與降低結膜上皮細胞中Caspase-3、Caspase-6的表達活性從而阻斷相關細胞凋亡級聯反應相關。

〔關鍵詞〕 養陰潤目丸;干眼;結膜上皮細胞;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6

〔中圖分類號〕R285.5;R276.7? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.012

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Yangyin Runmu Pills on the expression of Cysteine aspartase-3 （Caspase-3） and Cysteine aspartase-6 （Caspase-6） in conjunctival epithelial cells in a rat model of dry eye. Methods A total of 50 Sprague-Dawley （SD） male rats were randomly divided into 5 groups： normal group， sham operation group， model group， Yangyin Runmu Pills group， Qiju Dihuang Pills group， with 10 rats in each group. The model group， the Yangyin Runmu Pills group and the Qiju Dihuang Pills group were prepared as the models of dry eye by using the method of ovariectomy. Each group was given corresponding intervention. After 30d intervention， the conjunctival epithelial tissues were taken to test the positive expressive rate of Caspase-3 and Caspase-6 by Tunel assay. Results The positive expressive rates of Caspase-3 and Caspase-6 in conjunctival epithelial cells in the Yangyin Runmu Pills group and the Qiju Dihuang Pills group were significantly lower than that of the model group （P<0.05）. Conclusion The mechanism of action of Yangyin Runmu Pills on dry eye may be related to the inhibition of Caspase-3 and Caspase-6 expressive activities in conjunctival epithelial cells， thereby blocking the correlation of related apoptosis cascade reactions.

〔Keywords〕 Yangyin Runmu Pills; dry eye; conjunctival epithelial cells; Caspase-3; Caspase-6

干眼（dry eye disease， DED）是眼表的一種多因子疾病，特征是淚膜穩態的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經感覺異常[1]。干眼是眼科常見病，老年人患病多與自身因素相關，其患病率隨年齡呈線性增長[2]。近年來隨著手機、電腦、角膜接觸鏡的普及使用，睡眠時間的減少，空氣污染等多種因素的影響，干眼的患病率逐步呈年輕化趨勢[3-5]。項目組前期研究表明[6-7]，對于干眼的治療，養陰潤目丸具有良好臨床療效，而養陰潤目丸治療干眼的有效作用機制尚不明確，本項目組擬通過建立干眼動物模型，研究養陰潤目丸對大鼠結膜上皮細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6（Caspase-6）的表達的影響。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

清潔級7～8周健康SD雄性大鼠50只，體質量180～200 g，由湖南省長沙市斯萊克景達實驗有限公司提供（動物許可證號：SCXK（湘）2014-0002）。所有動物均通過淚液分泌試驗、淚膜破裂時間篩查，檢查正常方可使用。統一飼養于湖南中醫藥大學SPF級動物實驗中心，控制室溫（23±2）℃，相對濕度53%～57%。

1.2? 藥品及主要試劑

養陰潤目丸（湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供），杞菊地黃丸（九芝堂股份有限公司，201505001）。Caspase-3（PB0183）、Caspase-6（BA3328）、4%多聚甲醛（AR1069）、Tunel檢測試劑盒（MK1020）均來自武漢博士德公司。淚液檢測濾紙條（天津晶明新技術開發有限公司，20150903）。

1.3? 主要儀器

Shandon 325 型石蠟切片機（英國珊頓公司），MIAS醫學圖像分析系統（北航公司），研究型正置顯微鏡（olympus）。

1.4? 分組與給藥方法

按隨機數字表法將50只SD雄性大鼠分成5組，10只/組，分別為正常組、假手術組、模型組、養陰潤目丸組、杞菊地黃丸組。正常組不做任何處理，假手術組只切開陰囊而不切除睪丸及附睪，模型組、養陰潤目丸組、杞菊地黃丸組3組大鼠參照干眼動物模型的操作[8-9]，切除睪丸及附睪。術后常規消毒、保溫、分籠飼養。養陰潤目丸組、杞菊地黃丸組分別以藥物0.94 g/kg與生理鹽水混懸液灌胃，1次/d;正常組、假手術組、模型組3組分別以生理鹽水灌胃，1次/d，連續灌胃30 d。

1.5? Tunel法檢測Caspase-3、Caspase-6

各組大鼠治療30 d后，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，剪刀分離大鼠眼球周邊組織并剝離出眼球結膜上皮，4%多聚甲醛固定后冷存待檢。常規石蠟包埋、切片。3% H2O2去離子水孵育10 min，蒸餾水洗2 min×2次，Proteinase K（1∶200稀釋）消化10 min，滴加標記緩沖液（20 μL）2 h后，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3次，滴加封閉液室溫保存30 min，滴加生物素化抗地高辛抗體（1∶100稀釋），室溫孵育10 min后，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3次，滴加Caspase-3或Caspase-6抗體（1∶100稀釋），室溫孵育30 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min×3次，然后DAB顯色、復染、脫水、封片。高倍鏡下觀察每張涂片，至少觀察5個視野以上，計數視野內的細胞總數，如細胞核中有明顯的棕黃色或棕褐色顆粒即為陽性表達，即凋亡的細胞，分別計算其陽性細胞比率。

1.6? 統計學方法

采用SPPS 17.0軟件進行數據分析，實驗數據以“x±s”表示。如符合正態性及方差齊性，則用多因素方差分析兩兩比較法;如不符合正態性及方差齊性，則用非參多重比較法。以P<0.05（雙側檢驗）為有統計學差異。

2 結果

治療30 d后，正常組、假手術組結膜上皮細胞核內幾乎無明顯棕黃色或棕褐色，即Caspase-3、Caspase-6幾乎無陽性表達;養陰潤目丸組和杞菊地黃丸組結膜上皮部分細胞核內可見棕黃色沉著，及Caspase-3、Caspase-6存在不同程度陽性表達，分別與正常組、假手術組比較，結膜上皮細胞凋亡陽性比率差異均有統計學意義（P<0.05），但養陰潤目丸組與杞菊地黃丸組比較差異均無統計學意義（P>0.05）;模型組結膜上皮細胞核內可見大量棕黃色沉著，即Caspase-3、Caspase-6大量陽性表達，結膜上皮細胞凋亡陽性比率分別同養陰潤目丸組和杞菊地黃丸組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖1-2。

3 討論

已有研究表明[10]，角結膜上皮細胞的凋亡，被認為是損傷眼表正常形態與功能的主要途徑。處于細胞凋亡下游的蛋白酶家族Caspases家族在凋亡早期啟動并傳遞凋亡信號，于凋亡晚期作用于不同凋亡底物，使其產生細胞皺縮、DNA斷裂等凋亡特征現象[11]。Caspases-3是細胞凋亡效應子，其降解凋亡標志底物的活性最強[12]，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路。而Caspases-6能被上游的啟動子激活，作用于凋亡標志底物使細胞發生生化及形態學改變。Caspases-3和Caspases-6之間的相互活化可能與Caspase的級聯放大效應有關[13]。因此，通過干預Caspases-3、Caspases-6蛋白酶的表達，就有可能阻斷其相關細胞凋亡通路級聯反應的發生發展。

干眼屬于中醫學“白澀癥”范疇。臨床表現為“不腫不赤，不得爽快，沙澀昏朦，名曰白澀”（《審視瑤函》）。中醫學認為，“淚乃肝之液”（《銀海精微》），“腎主津液，潤養目珠”，當肝腎虧虛，淚液分泌不足，目失滋潤，則致干眼。養陰潤目丸具有滋養肝腎、生津潤燥功效，治療干眼，臨床療效顯著。本研究發現，以模型組與正常組、假手術組比較，大鼠結膜上皮細胞中Caspases-3、Caspases-6陽性表達率均有顯著性差異，證實細胞凋亡機制與干眼的發生發展關系密切。經過養陰潤目丸的干預后，大鼠結膜上皮細胞中Caspases-3、Caspases-6的陽性表達率要明顯低于模型組，由此我們推斷，通過降低Caspases-3、Caspases-6的表達活性，以阻斷相關細胞凋亡級聯反應，可能是養陰潤目丸有效治療干眼的作用機制，其關鍵因素是否是養陰潤目丸中的某些有效成分或是滋養肝腎治法，還有待進一步探索。

參考文獻

[1] NlSON J D， CRAIG J P， AKPEK E K， et al. TFOS DEWS Ⅱ introduction[J]. Oculal Surface， 2017，15（3）：269-275.

[2] GUO B， LU P， CHEN X M， et al. Preva-lence of dry eye disease in Mongolians at high altitude in China：the Henan eye study[J]. Ophthalmic Epidemiol， 2010，17（4）：234-241.

[3] 盧媛媛，許璐潔，蔡龍龍，等.西安市某高校大學生干眼調查研究[J].中國地方病防治雜志，2018，33（2）：195-197.

[4] 胡? 青.眼科門診40歲以下人群干眼癥患病情況及危險因素分析[J].世界最新醫學信息文摘，2018，18（45）：250-251.

[5] 黃? 樺，鄒文進.視頻顯示終端使用時間及睡眠時間與兒童干眼的關系[J].廣東醫學，2018，39（5）：701-709.

[6] 李? 點，王超群.養陰潤目丸治療干眼癥的臨床觀察[J].南京中醫藥大學學報，2016，32（4）：386-388.

[7] 金? 燦，李? 點，呂? 佳.養陰潤目丸治療干眼的臨床研究[J].中醫藥導報，2018，24（6）：387-389.

[8] 張? 燕，謝? 軍，徐藝玫，等.去勢大鼠干眼癥模型眼表損傷的研究[J].生物醫學工程研究，2013，32（2）：97-100.

[9] 彭? 俊，歐陽云，譚涵宇，等.密蒙花滴眼液對去勢雄兔干眼癥淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（5）：469-472.

[10] DONG Z H， WANG D C， LIU T T， et al. The roles of MAPKs in rabbit nucleus pulposus cell apoptosis induced by high osmolality[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2014，18（19）：2835-2845.

[11] RONGVAUX A， JACKSON R， ARMAN C C， et al. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA [J].Cell，2014，159（7）：1563-1577.

[12] 熊建衛，戴? 閩，郝? 亮，等.金屬離子刺激人單核細胞分泌TNF-α并誘導其凋亡與Caspase-3激活的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志，2009，23（3）：299-302.

[13] 趙瑞杰，李引乾，王? 會，等.Caspase家族與細胞凋亡的關系[J].中國畜牧雜志，2010，46（17）：73-78.