大群體轉(zhuǎn)基因大麥后代快速篩選研究

李靜雯 張正英 王立光 陳軍 朱天地

摘要：以攜帶有潮霉素標記基因的RNAi轉(zhuǎn)基因大麥和常規(guī)大麥為材料，采用葉片涂抹法進行了潮霉素篩選濃度確定及轉(zhuǎn)基因大麥T2代和回交后代的篩選和PCR檢測。結(jié)果表明，3 000 mg/L潮霉素連續(xù)涂抹3次，5 d后轉(zhuǎn)基因大麥涂抹區(qū)域無受害癥狀，生長受害率顯著低于無涂抹處理。潮霉素涂抹檢測結(jié)果與其PCR檢驗結(jié)果的符合度為96.2%，目的基因篩選準確率可達61.8%。表明所建立的活體幼苗潮霉素葉片涂抹法篩選轉(zhuǎn)基因大麥快速，直觀、準確，具有一定可行性。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因大麥;潮霉素;潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因;葉片涂抹

中圖分類號：S512.3? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2019）08-0012-06

Abstract：Using RNAi transgenic barley and conventional barley carrying hygromycin marker gene as experimental materials， the concentration of hygromycin screening by leaf smearing method was determined， and the screening and PCR detection of T2 generation and backcross progenies of transgenic barley were carried out. The results showed that 3 000 mg/L hygromycin was applied for three times continuously. After 5 days， no symptoms were found in the smearing area of GM barley， and the rate of growth damage was significantly lower than that of non-smearing treatment. The coincidence between the results of hygromycin smear test and those of PCR test was 96.2%， and the accuracy of target gene screening was up to 61.8%. Therefore， the hygromycin leaf smear method for screening transgenic barley was rapid， intuitive and accurate， and had certain feasibility.

Key words：Transgenic barley;Hygromycin;Hygromycin phosphotransferase gene（hpt）;Leave painting

大麥是全球普遍栽培的第四大禾谷類作物，不僅用途多樣，而且適應(yīng)性廣，既是糧食和飼料，也是生產(chǎn)啤酒的重要原料，具有良好的耐旱性、耐寒性和耐鹽性[1 ]，是遺傳和生理研究的模式種類[2 - 3 ]。自1994年首次獲得可育轉(zhuǎn)基因大麥植株以來，大麥轉(zhuǎn)基因的研究發(fā)展迅速，已成為實現(xiàn)基因功能驗證和作物育種的重要方法[4 - 5 ]。隨著最近高質(zhì)量的大麥基因組參考序列的公布[6 - 7 ]，為谷物的全面遺傳和基因組研究提供了重要資源，也為大量基因的功能研究提供了基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)基因大麥獲得后，如何快速有效地從龐大的轉(zhuǎn)基因后代群體中檢測出攜帶有目的基因的轉(zhuǎn)基因植株是轉(zhuǎn)基因大麥研究的重要環(huán)節(jié)。基于抗生素-篩選標記基因等建立的抗生素篩選體系，由于其經(jīng)濟、簡便、直觀，對于轉(zhuǎn)基因純系種質(zhì)的篩選和轉(zhuǎn)基因親本與雜交組合純度的檢測具有指導(dǎo)意義[8 ]。大麥轉(zhuǎn)化中潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Hpt II是采用較多的篩選標記[9 ]，其產(chǎn)物的作用底物潮霉素B（Hygromycin B）是一種氨基糖苷類抗生素，通過競爭葉綠體和線粒體中的核糖體與延長因子EF-2的結(jié)合位點，破壞各種細胞中核糖體的功能，從而抑制蛋白的合成，使敏感組織褐化死亡[10 ]。潮霉素通過干擾蛋白質(zhì)合成以抑制植物生長，可以幫助篩選轉(zhuǎn)化外源基因的細胞、組織和再生植 株[11 - 12 ]。利用潮霉素涂抹葉片快速篩選轉(zhuǎn)基因植株的方法，在水稻與楊樹中已有報 道[13 - 14 ]。在轉(zhuǎn)基因大麥中關(guān)于潮霉素的研究多見于遺傳轉(zhuǎn)化階段，后代規(guī)模化篩選方面的報道較少。我們開展了轉(zhuǎn)基因大麥及常規(guī)品種不同濃度潮霉素葉片涂抹的鑒定，并對大群體轉(zhuǎn)基因大麥及回交后代篩選效果進行了研究，以期對實現(xiàn)大群體轉(zhuǎn)基因大麥的快速選擇、加快育種進程提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試大麥品種為甘啤4號，Golden Promise，轉(zhuǎn)基因大麥9份T2代材料（分別為242-01-01、242-03-01、242-06-01、242- 10-01、242-17-01、242-18-01、242-20- 01、242-24-01、242-02-01）以及轉(zhuǎn)基因大麥與甘啤4號回交后代材料1份（RNAi-BC3）。該轉(zhuǎn)基因大麥為甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所創(chuàng)制的以“Golden Promise”為受體獲得的帶有hpt基因的RNAi B-hordein 轉(zhuǎn)基因大麥[15 ]，甘啤4號為甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的優(yōu)質(zhì)啤酒大麥品種[16 - 17 ]，不帶hpt基因。試驗用潮霉素B由Roche公司生產(chǎn)。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 潮霉素篩選濃度的確定? ? 將甘啤4號、Golden Promise及以轉(zhuǎn)基因大麥種植于育苗缽，在溫度25 ℃、光照/黑暗16 h/8 h條件下培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，共設(shè)置了500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、 4 000 mg/L 7個潮霉素濃度。在3葉1心期將配制的Hyg溶液用醫(yī)用棉簽均勻涂抹于第2葉，涂抹區(qū)域2 cm左右，以浸潤為準，連續(xù)涂抹3 d，掛牌標記。涂抹后第5天觀察葉片的反應(yīng)，統(tǒng)計生長受害率，以明確潮霉素涂抹后大麥葉片的變色效果和不同類型大麥幼苗的潮霉素敏感濃度。

1.2.2? ? 潮霉素葉片涂抹篩選法在大麥轉(zhuǎn)基因后代及回交后代篩選中的驗證? ? 在確定的篩選條件下，對已導(dǎo)入外源基因hpt和RNAi構(gòu)件的9個轉(zhuǎn)基因大麥株系的T2代幼苗及回交后代進行抗性篩選，5 d后統(tǒng)計篩選結(jié)果。剪取抗性幼苗的新鮮葉片，采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取大麥基因組DNA作為模板，進行hpt和B-hordein RNAi干涉構(gòu)件片段PCR檢測。潮霉素和目的基因引物序列、反應(yīng)體系和條件見文獻[18 ]。

抗性篩選有效率（%）=（PCR陽性株數(shù)/抗性苗數(shù)）×100%。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?潮霉素涂抹后大麥葉片表現(xiàn)

Hyg涂抹5 d后觀察發(fā)現(xiàn)，大麥葉片涂抹區(qū)域呈現(xiàn)不同程度的受害癥狀（圖1）。大麥葉片對Hyg處理后的最終反應(yīng)程度劃分為3個等級：Ⅰ為涂抹部位葉色正常;Ⅱ為涂抹部位葉片出現(xiàn)點狀褐化，葉色仍為綠色;Ⅲ為涂抹部位大片褪綠，葉片黃化，嚴重者呈灼燒狀。甘啤4號及對照Golden Promise涂抹區(qū)域黃化，葉片死亡，攜帶有hpt的轉(zhuǎn)基因大麥涂抹區(qū)域葉色正常（圖1-a）。

葉片Ⅲ級反應(yīng)，基本上消除了葉片自身對潮霉素處理的負面效應(yīng)，可作為潮霉素起始篩選的標準。

2.2? ?潮霉素篩選濃度的確定

通過表1可以看出，隨著篩選濃度升高，大麥品種潮霉素涂抹區(qū)域受害程度均加重，生長受害率上升。不同品種大麥幼苗在不同潮霉素涂抹濃度下葉片受害表現(xiàn)有所差異。甘啤4號在2 000 mg/L潮霉素處理后葉片發(fā)黃，其生長受害率達100%，顯著高于其他處理;Golden Promise大麥葉片在潮霉素濃度≤1 500 mg/L，葉片無傷害，當濃度為2 500～4 000 mg/L時生長受害率各處理無顯著差異，但是葉片受害程度不同，濃度為3 000 mg/L以上時葉片灼燒狀嚴重。轉(zhuǎn)基因大麥在3 000 mg/L時葉片涂抹區(qū)域無變化。因此確定以3 000 mg/L作為轉(zhuǎn)基因大麥后代篩選濃度。

2.3? ?潮霉素篩選方法在大麥轉(zhuǎn)基因后代及回交后代篩選中的驗證

對RNAi B-hordein轉(zhuǎn)基因大麥9個轉(zhuǎn)化事件T2代材料共計765株轉(zhuǎn)基因后代幼苗于3葉1心期進行3 000 mg/L潮霉素涂抹，5 d后統(tǒng)計篩選結(jié)果。結(jié)果顯示，404株幼苗表現(xiàn)抗性，抗性篩選有效率達96.2%，表明利用3 000 mg/L 潮霉素在3葉1心期涂抹篩選轉(zhuǎn)基因大麥后代是可行的。之后篩選轉(zhuǎn)基因大麥與甘啤4號回交后代（RNAi-BC3）83株幼苗，獲潮霉素陽性株42株，抗性篩選有效率達66.7% （表2，圖2-A）。

為進一步明確潮霉素PCR陽性株是否存在B-hordein RNAi構(gòu)件，選取2個轉(zhuǎn)化事件共計170株進行目的基因正反向片段PCR檢測，其中105株檢測到同時含有醇溶蛋白基因正反向片段，表明潮霉素篩選? ?B-hordein RNAi 構(gòu)件的準確率為61.8%。回交后代的目的基因檢測準確率為75.0%（表3，圖2-B）。

3? ?小結(jié)與討論

通過對大麥活體幼苗葉片開展潮霉素涂抹篩選研究，建立了潮霉素快速篩選大群體轉(zhuǎn)基因大麥后代的方法。研究表明，在3葉1心期采用3 000 mg/L的潮霉素溶液對嫩葉進行連續(xù)3 d的涂抹，根據(jù)5 d后葉片涂抹區(qū)域受害癥狀可快速區(qū)分轉(zhuǎn)基因植株，潮霉素基因PCR檢測符合度可達96.2%，目的基因篩選準確率可達61.8%。該方法篩選轉(zhuǎn)基因大麥后代快速、直觀、準確，可行性高。

本研究發(fā)現(xiàn)，潮霉素快速選擇的效果因涂抹濃度、觀測時間變化很大，這與殷奎德等[18 ]的結(jié)果一致。首先，只有選擇超過轉(zhuǎn)基因大麥自身抗性范圍的處理濃度（如大麥敏感型的潮霉素濃度 > 2 000 mg/L）時，才能進行有效篩選，否則會增加假陽性單株的數(shù)量，影響選擇的效果。其次，葉片生長的不同狀態(tài)對潮霉素處理結(jié)果有很大影響，新展開的葉片對潮霉素較敏感，越老的葉片對其抗性越強，為減少誤差應(yīng)于3葉1心期挑選生長一致的、完全展開的葉片為檢測對象，以提高選擇的準確性。此外，在潮霉素液中添加粘著劑（表面活性物質(zhì)）涂抹效果更好。外界天氣也會對涂抹效果有影響，如果涂抹期間有雨，最好再行補涂1次。

抗生素標記基因一般都與目的基因以連鎖的方式構(gòu)建在同一T-DNA上[8 ]，理論上目的基因構(gòu)件存在于篩選出的轉(zhuǎn)基因大麥潮霉素陽性株，但是由于RNAi轉(zhuǎn)基因大麥目的基因PCR反應(yīng)易于變化，實際操作中需要探索出適合的退火溫度等反應(yīng)條件以便于更好的篩查出目的基因陽性株。

伴隨大量的轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生，標記基因的安全性是轉(zhuǎn)基因食品安全性關(guān)注的焦點問題之一。目前已有共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)法、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)法、位點特異性重組系統(tǒng)法、重組酶系統(tǒng)法、外源基因清除技術(shù)及葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)可培育新的無選擇標記的轉(zhuǎn)基因作物[8 ]，但這些技術(shù)只適用于新的無標記轉(zhuǎn)基因植株的培育。有研究者認為可通過人工理化誘變，將現(xiàn)有的已經(jīng)育成有重大應(yīng)用價值轉(zhuǎn)基因材料中的hpt 基因剔除或部分片段失活[19 ]。此外，在食品安全方面，有研究表明潮霉素蛋白潛在致敏性很低，在加工食品中均已不同程度的發(fā)生了降解，對生物安全的影響很 小[20 - 21 ]。

參考文獻：

[1] 史戴文·E.揚烏爾里希.? 大麥生產(chǎn)、改良與利用[M].? 張國平，鄔飛波，等譯.? 杭州：浙江大學(xué)出版社，2012：1-3.

[2] DAWSON I K，RUSSELL J，POWELL W.? et al. Barley：A translational model for adaptation to climate change[J]. New Phytol，2015（206）：913-931.

[3] PURUGGANAN M D，F(xiàn)ULLER D Q.? The nature of selection during plant domestication[J]. Nature，2009（457）：843-848.

[4] WAN Y，LEMAUX P G.? Generation of large numbers of independently transformed ertile barley plants[J].? Plant Physiology，1994，104：37-48.

[5] 張仲博，張玉紅，韓? ?凝，等.? 大麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進展及其應(yīng)用[J].? 麥類作物學(xué)報，2011，31（3）：560-568.

[6] DAI F，WANG X L，ZHANG X Q，et al.? Assembly and analysis of a qingke reference genome demonstrate its close genetic relation to modern cultivated barley[J].? Plant Biotechnology Journal，2018（16）：760-770.

[7] MASCHER M，GUNDLACH H，HIMMELBACH A，et al.? A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome [J].? Nature，2017（544）：427-433.

[8] 王關(guān)林，方宏筠.? 植物基因工程（第二版）[M].? 北京：科學(xué)出版社，2014.

[9] 韓秀麗，王文良，田? ?田.? 大麥轉(zhuǎn)化中潮霉素和草丁膦的篩選效果研究[J].? 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，44（4）：525-532.

[10] OLHOFT P M，F(xiàn)LAGEL L E，DONOVAN C M，et al.? Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method[J].? Planta，2003，5：723-735.

[11] HIEI Y，OHTA S，TORIYAMA K，et al. Efficient transformation of rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. The Plant Jouranl，1994，6：271-282.

[12] ALDEMITA RR， HODGES TK.? Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Japanica and indica rice varieties[J]. Planta， 1996，199：612-617.

[13] 富昊偉，沈圣泉，李友發(fā)，等.? 水稻穗期活體植株對潮霉素的敏感性分析及突變體選育[J].? 核農(nóng)學(xué)報，2012，26（2）：198-202.

[14] 王? ?丹，鄒? ?莉，王? ?義，等.? 楊樹對潮霉素的敏感性研究[J].? 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32（1）：47-50.

[15] 李靜雯，張正英，令利軍，等.? 利用RNAi 抑制B-hordein 合成降低大麥籽粒蛋白質(zhì)含量[J].? 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（19）：3746-3756.

[16] 徐銀萍，潘永東，方彥杰，等.甘啤系列7個啤酒大麥品種在武威市的比較試驗初報[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2014（1）：6-8.

[17] 王效宗，潘永東，陳? 富.? 啤酒大麥新品種甘啤4號選育報告[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2003（3）：8-10.

[18] 殷奎德，張興梅，鄭桂萍，等.? 一種快速檢測轉(zhuǎn)基因水稻潮霉素抗性標記的方法[J].? 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2010，22（2）：45-48.

[19] 李友發(fā)，富昊偉，陸? ?強.? 轉(zhuǎn)基因及常規(guī)水稻穗期對潮霉素的敏感性[J].? 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（3）：273-275.

[20] 徐文濤，蘆? ?云，羅云波，等.? 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的致敏性評價研究[J].? 食品科學(xué)，2009，30（1）：261-264.

[21] 沈立明，吳永寧，張建中，等.? 不同加工條件下轉(zhuǎn)基因大米潮霉素標記基因（hpt）穩(wěn)定性研究[J].? 衛(wèi)生研究，2006，35（4）：431-434.

（本文責編：陳? ? 偉）