高色價紅曲米液態制種的培養條件優化

黃穎穎 陳慎 楊成龍

摘 要：為進一步研究液態制種的培養條件對高色價紅曲米的影響，提高液態種子液中紅曲霉菌絲體數量和質量，更好地縮短發酵周期，促進高品質紅曲米規模化大生產，對液態制種過程中的培養周期、培養溫度、接種量、培養基起始pH值和裝液量等主要培養條件進行優化。試驗結果表明：紅曲霉液態制種的最適培養條件為液態制種培養基的起始pH 5.5，接種量6%，培養溫度35℃，培養周期24 h。經優化紅曲霉的液態制種工藝，紅曲米色價達6000～6200 u·g-1，發酵周期10～12 d，產品得率達35%～38%。

關鍵詞：紅曲霉;液態制種;紅曲色素;色價

Abstract：In order to further research the effects of the culture conditions of liquid seed production on red yeast rice with high color value， improve the quantity and quality of monascus mycelium in liquid seed solution， shorten the fermentation period and promote the largescale production of highquality red yeast rice， the main culture conditions such as culture cycle， culture temperature， inoculum size， initial pH value of culture medium and loaded liquid were optimized. The results showed that the optimal culture conditions for liquid seed production of monascus were the initial pH of liquid seed production medium of 5.5， inoculum size of 6%， culture temperature at 35℃ and culture cycle of 24 h. After optimizing the liquid seed production process of monascus， the color value of red yeast rice was up to 6000-6200 u·g-1， the fermentation period was 10-12 d， and the production yield was up to 35%-38%.

Key words：Monascus; Liquid seed production; Monascus pigment; Color value

紅曲色素是絲狀真菌紅曲霉的次級代謝產物，為食品添加劑中允許使用的唯一微生物來源的天然色素。近年來，由于紅曲色素具有性質穩定、耐熱性強，對蛋白質著色力好等優點，可取代亞硝酸鹽（一級致癌物），在肉制品加工和水產品加工領域的使用量迅速增加，已躍升到紅曲米和紅曲色素最主要的應用領域，成為世界上生產量及使用量最大的天然食用色素之一[1]。由于紅曲霉的生長速度相對緩慢，在紅曲發酵生產的前期容易被雜菌污染，因此高色價紅曲米的工業化生產一般采用純種紅曲二級種子制作的方法。傳統的純種紅曲二級種子制作的方法是三角瓶固態菌種發酵法，培養紅曲米作為紅曲二級種子用于后續工業化生產。固態紅曲米二級種子方便貯藏，但存在培養周期長、種子萌發緩慢、菌絲體生長不均勻等缺點。相比而言，液態二級種子懸浮液以其菌絲體粗壯、萌發點多且萌發面積大等優勢已成為工廠化生產的發展方向[2]。采用液態制種取代傳統的固態制種工藝，不僅能使紅曲米發酵前期紅曲霉萌發迅速成為優勢菌，縮短發酵時間，而且能有效防止發酵前期易染雜菌的弊端，促進規模化大生產。

本課題組前期研發出一套純種紅曲液態制種工藝，但該工藝中存在菌絲體早衰、后期紅曲米色價不高等問題。本試驗采用本實驗室保存的1株高色價紅曲霉菌株，通過對前期液態制種的優化和紅曲米產品色價的關系進行探討，并通過二次旋轉正交設計，探究液態制種工藝與紅曲米產品色價的關系，以期得到高色價紅曲產品的最優液態制種培養工藝。通過研究液態制種培養條件控制對紅曲霉菌絲體生長持續性、產色能力、紅曲米發酵周期及其產品品質的影響，優化液態制種工藝，將對福建省紅曲產業的技術進步、提高福建省紅曲行業的國內外市場競爭力具有積極意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 由本實驗室特有的工業化生產價值的紅曲霉菌專用種質資源庫中篩選鑒定的代表性紅曲霉菌株為研究對象。

1.1.2 儀器和試劑 恒溫培養振蕩器SKY200B（上海蘇坤實業有限公司）;分光光度計721型（上海精密科學儀器有限公司）;無油真空泵HP01（天津市恒奧科技發展有限公司）;生化培養箱LRH150（上海一恒科技有限公司）;水浴鍋（上海寶磊儀器有限公司）;電熱恒溫鼓風干燥箱DHG9070型（上海一恒科技有限公司）;手提式滅菌器DSX280A1（上海申安醫療器械廠）;潔凈工作臺SWCJIFD（蘇州安泰空氣技術有限公司）;電子天平AR2140[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]。

1.1.3 培養基 試管斜面培養基：麥芽汁10oBé、pH 6～7、瓊脂2%，121℃滅菌30 min。

液態種子基本培養基：6%大米粉、2.5%蛋白胨、0.15% NaNO3、0.15% KH2PO4、0.1% MgSO4、pH 5.5。在250 mL三角瓶中裝50 mL液態種子培養基并加入數顆小玻璃珠，121℃滅菌30 min。

固態發酵基本培養基：將糙米洗凈后，與浸米水1∶1的比例浸泡6 h后瀝干水分，121℃滅菌20 min后冷卻備用。

1.2 紅曲米培養工藝和色素的測定及計算方法

1.2.1 紅曲米培養工藝流程

1.2.2 紅曲霉試管斜面種子的制備 在無菌條件下，將紅曲霉試管原菌接入試管斜面培養基中，置于35℃的恒溫生化培養箱中培養13 d，備用。

1.2.3 紅曲霉液態種子的制備 將菌種從斜面種子接到一級液態種子培養基后，置于35℃恒溫搖床內，160 r·min-1振蕩培養2 d后，按6%接種量接到二級液態種子培養基中，置于恒溫搖床內培養1 d取出現用。

1.2.4 紅曲米固態發酵培養 將二級液態種子接入固態發酵培養基中，于35℃恒溫培養13 d，其間每12 h搖瓶1次，以防止培養基結塊，培養48 h后每個三角瓶中分別補無菌水5 mL。培養結束后，取出紅曲米于60℃通風干燥至含水量12%以下備用。試驗各處理均為3次重復。

1.2.5 紅曲米色價的測定及計算方法 參照國家標準《GB 1886.19-2015 食品添加劑紅曲米（粉）》[3]進行檢測。

1.2.6 菌絲體生物量測定 發酵液用紗布過濾，濕菌體用蒸餾水洗滌后，于60℃烘干至恒重后稱重。

1.2.7 紅曲米桔霉素的測定及計算方法 參照國標《GB/T 5009.222-2016 食品中桔青霉素的測定》[4]進行檢測。

1.2.8 紅曲米得率 固態發酵培養結束后，取出紅曲米于60℃通風干燥至含水量12%以下，稱質量，計算紅曲米占初始糙米質量的比例為紅曲米得率。

1.3 試驗設計

1.3.1 液態制種的培養時間對液態種子液中菌絲體生物量和色價影響的研究 在pH 5.5，溫度35℃培養，每隔6 h測生物量和色價，每個水平3次重復進行單因素試驗，考察不同培養時間對紅曲霉生物量和紅曲米色價的影響。

1.3.2 液態制種的培養溫度對液態種子液中菌絲體生物量和色價影響的研究 在pH 5.5，培養溫度分別為26℃、29℃、32℃、35℃、38℃培養，每個水平3個重復進行單因素試驗，考察不同培養溫度制種對紅曲霉生物量和紅曲米色價的影響。

1.3.3 紅曲霉液態制種培養條件的正交試驗 以pH、轉速、裝液量三因素為研究對象，分別取3個水平，以505 nm處色價為參考指標進行三因素三水平試驗，因素水平表見表1。

1.4 數據統計分析

采用Microsoft Office Excel 2007版辦公軟件進行統計處理試驗數據，利用t檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 液態制種的培養時間對液態種子液中菌絲體生物量和色價的影響

從圖2可知，紅曲霉菌絲體次級代謝產生紅曲色素，液態種子液中的菌絲體生物量和色價會隨著液態種子培養時間的增加而增加，但到達一定程度后反而會有所下降，因此要控制好培養時間，選用液態種子液中菌絲體生物量達到最高且最粗壯旺盛的時間為培養周期，用于后續接種固態發酵培養。由圖2可以看出，前24 h為菌體生長期，隨后48 h是色素代謝期，再往后菌絲體生長和產色能力均減弱。菌絲體生物量均隨著培養時間的增加而先增大后逐漸減少。當培養時間為2 d時，菌株的產色能力達到最大，色價逐漸趨于平緩。同時，用顯微鏡對菌株進行涂片觀察菌絲和孢子的萌發狀況，菌株的菌絲體粗壯，孢子萌發情況好（圖3），與試驗結果相符合。因此，選擇液態種子培養24 h為后續試驗的培養周期條件。

2.2 液態制種的培養溫度對液態種子液中菌絲體生物量和色價的影響

從圖4可知，溫度的調節控制是影響有機體生長繁殖的最重要因素之一，因為任何生物化學的酶促反應都與溫度變化有關。根據酶促反應的動力學來看，溫度升高，反應速度加快，呼吸強度增加，最終導致細胞生長繁殖加快。但隨著溫度的上升，加快細胞的自溶速度，同時酶失活的速度也加大，影響生物的代謝產物。通過試驗可知，在35℃附近效果最好。

2.3 紅曲霉液態制種培養條件的正交優化

從正交試驗結果的極差分析表2和方差分析表3可以看出，液態種子培養條件中影響紅曲色素產量的主次因素為：pH>轉速>裝液量。在試驗范圍內，pH和轉速對紅曲霉產色素的影響均達顯著水平，且pH的影響是極顯著，這驗證了其他學者的結論，而裝液量的影響不顯著，三者的最優組合為A3B2C1，即pH 5.5，轉速180 r·min-1，裝液量50 mL·瓶-1（250 mL）。優化后的培養條件是：pH 5.5，轉速180 r·min-1，裝液量50 mL·瓶-1（250 mL），培養時間1 d，培養溫度35℃。在此條件下制備的液態種子液用于紅曲米固態培養，紅曲霉產色素的色價可達到6105.6 u·g-1。

3 結論與討論

紅曲霉作為我國重要的微生物資源和工業生產用菌，在食品工業中應用極廣。紅曲產品可分為酒曲、色曲和功能曲三類，除可發酵制成多種傳統食品， 如紅曲米、紅曲黃酒、紅腐乳等，還能合成廣泛的具有生物活性的天然產物，如紅曲色素，膽固醇抑制劑洛伐他汀及具有降血壓、抗藥、抗腫瘤、降糖生理活性的成分等[5]。與其他工業微生物相比，紅曲菌具有有益產物多樣性和高產性的特點，是國際范圍內增長速度最快、產量和使用量最大的天然著色劑品種。藥理研究表明，紅曲色素具有廣泛的生理活性，如抑制細胞癌變、抗菌活性、消除活性氧和抗突變等功效[6-7];又因其性質安全穩定、耐熱性強，和對蛋白質著色力好等優點，近年來在食品工業上作為食品著色劑、食品原料廣泛應用于肉制品加工和水產品加工領域，市場前景廣闊。

我國是紅曲的主要生產國，福建省又是我國紅曲傳統的發源地和主產區，其紅曲產量和出口量均超過全國的一半以上，已出口到美國、法國、德國、日本和韓國等國家。福建紅曲以品質優、色價高的特點，在國內外一直享有極高聲譽[8]。歐亞各國以食品配料從中國進口紅曲，用于火腿腸生產，其進口量已超過我國總產量的一半，因此具有廣闊的應用前景[9]。本試驗以紅曲霉生物量和產色能力為考察指標，對液態制種培養條件進行優化。通過進行單因素和響應面優化試驗，確定適宜的液態制種培養工藝。優化后的液態制種工藝為（一級種子和二級種子）：6%大米粉、2.5%蛋白胨、0.15% NaNO3、0.15% KH2PO4、0.1% MgSO4、pH 5.5，培養各24 h，培養溫度35℃，轉速180 r·min-1，裝液量50 mL·瓶-1 （250 mL）。按6%接種量生產紅曲米，紅曲米色價達6000～6200 u·g-1，發酵周期10～12 d，產品得率達35%～38%。通過研究紅曲霉液態制種工藝對紅曲米產色素能力的影響，提高液態種子液中紅曲霉菌絲體數量和質量，進而縮短發酵周期，實現高品質紅曲米規模化大生產。

參考文獻：

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[3]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 1886.19-2015食品添加劑紅曲米（粉）[S].北京：中國標準出版社，2015.

[4]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.GB/T 5009.222-2016食品中桔青霉素的測定[S].北京：中國標準出版社，2016.

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[7]黃穎穎，陸東和，楊成龍，等.微量營養源對紅曲霉產洛伐他汀開閉環組分的影響[J].福建農業學報，2015，30（3）：286-292.

[8]楊成龍，楊曉君，鄧思珊，等.幾種維生素對紅曲霉S產色素的影響[J].福建農業學報，2014，29（3）：266-270.

[9]楊成龍，陳章娥，吳小平，等.基因組ITS序列分析鑒定紅曲霉菌株[J].核農學報，2015，29（2）：252-259.

（責任編輯：柯文輝）