水稻品種空育131稻瘟病抗性基因座Pik鑒定及抗性分析

鄭祥正

摘 要：粳稻品種空育131具有熟期早、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)及耐低溫冷害等優(yōu)點，自引入我國后，已成為北方水稻種植區(qū)的重要品種之一，對該地區(qū)的糧食生產(chǎn)起著重要作用。利用Pik基因座的Pik、Pi1、Pikp、Pikm等功能基因的特異分子標(biāo)記，對空育131基因型進(jìn)行檢測及分析，并在福建省上杭縣稻瘟病重發(fā)區(qū)進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。結(jié)果表明：空育131品種中含有稻瘟病抗性基因Pik，在福建上杭縣稻瘟病重發(fā)區(qū)田間表現(xiàn)苗瘟0級、葉瘟4級、穗頸瘟3級、綜合抗性評價中抗。因此，空育131可作為抗源或育種材料。

關(guān)鍵詞：水稻;空育131;稻瘟病;抗性基因;分子標(biāo)記

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：0253-2301（2019）09-003

Abstract： The japonica rice variety Kongyu 131 had the advantages of earlymaturity， high and stable yield and low temperature and cold damage resistance. Since it was introduced into China， it has become one of the important varieties in the northern rice growing area， which played an important role in the food production in this area. By using the specific molecular markers of functional genes such as Pik、Pi1、Pikp、Pikm in Pik genetic loci， the genotype of kongyu 131 was detected and analyzed， and the resistance to rice blast was identified in the area with heavy rice blast in Shanghang County， Fujian Province. The results showed that the rice blast resistance gene Pik was contained in Kongyu 131， which showed 0 grade of seedling blast， 4 grade of leaf blast and 3 grade of neck blast in the area with heavy rice blast in Shanghang County， Fujian Province. Therefore， Kongyu 131 could be used as resistant material or breeding material.

Key words： Rice; Kongyu 131; Rice blast; Resistance gene; Molecular marker

由稻瘟病菌Magnapothe oryzae引起的稻瘟病導(dǎo)致水稻嚴(yán)重減產(chǎn)，并降低稻米品質(zhì)[1]。長期生產(chǎn)實踐表明，推廣高抗稻瘟病的水稻種質(zhì)是防治稻瘟病最為環(huán)保有效的措施[2]，而稻瘟病抗性鑒定是發(fā)掘抗性基因、抗性育種和推廣等工作中的核心環(huán)節(jié)。Pik抗性基因座位于水稻第11號染色體的長臂上，目前已在該位點克隆了至少7個稻瘟病抗性基因（Pi1、Pikp、Pikm、Pikh、Pik、Pike和Piks）[3-5]，在水稻抗病育種和推廣方面具有重要價值[4-7]。研究表明，Pik基因座等位基因介導(dǎo)的抗性由2個緊密連鎖、功能獨立的NBSLRR序列共同作用[6-9]。據(jù)此，可將Pik基因座分為K單元型（K1K2功能型）和N單元型（N1N2非功能型）[4]。

將抗病品種Kusabue（Pik）、Tsuyuake（Pikm）、K60（Pikp）、C101LAC（Pi1）等Pik基因座的2個NBSLRR序列和感病品種日本晴同源區(qū)域進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)該位點可分為K單元型（K1K2功能型）和N單元型（N1N2非功能型）[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Pikm、Pik、Pikp和Pi1 基因型取決K1、K2區(qū)間的6個SNP。因此，基于Pik基因座等位基因序列多態(tài)性開發(fā)的分子標(biāo)記能夠檢測Pik位點的不同等位基因。粳稻品種空育131具有熟期早、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)及耐低溫冷害等優(yōu)點，在我國東北地區(qū)大規(guī)模種植。本研究對水稻品種空育131的Pik基因座進(jìn)行K/N單元型多態(tài)性分析及基因分型，研究結(jié)果將為水稻稻瘟病抗性育種和福建地區(qū)品種推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

粳稻品種空育131、日本晴。

1.2 水稻葉片DNA提取及抗病基因特異性分子標(biāo)記檢測CTAB法提取水稻樣品DNA。利用Pik基因座基因特異性分子標(biāo)記，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

PCR 擴(kuò)增體系25 μL：水稻基因組DNA（20～30 ng·μL-1）1 μL，10×PCR 緩沖液 12.5 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA聚合酶0.3 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

反應(yīng)程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55～60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán);72℃ 5 min。

酶切體系為10 μL： PCR產(chǎn)物8 μL，10×酶切緩沖液1.5 μL，限制性內(nèi)切酶 0.5 μL，37℃酶切4 h，酶切產(chǎn)物在8%的PAGE膠電泳檢測。

1.3 稻瘟病菌鑒定抗病性

2018年在福建省上杭縣進(jìn)行田間稻瘟病抗性鑒定，分別在苗期、分蘗盛期和成熟期調(diào)查苗瘟、葉瘟和穗頸瘟。

2 結(jié)果與分析

2.1 空育131抗稻瘟病Pik位點K/N單元型多態(tài)分析

利用K型標(biāo)記Ku1GT和Ku2GT可以從IRBLkKa（Pik）和空育131的基因組分別檢測到1600 bp和4879 bp的片段，而日本晴無擴(kuò)增到產(chǎn)物，確定空育131存在K-單元型（K1K2功能型）[4]（圖1～2、表1）。

利用dCAPS2953、Pi1SNP、Pikp、PikmInDel、PikhFM等標(biāo)記對空育131的Pik位點進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其基因型與Pik相同，都不能被Kpn酶切，確定空育131含有Pik基因，而IRBLkKp（Pikp）PCR產(chǎn)物可以被Kpn酶切 （表1，圖3） 。

2.2 空育131在上杭縣的抗性鑒定

在福建省上杭縣對空育131和日本晴進(jìn)行田間抗性鑒定，結(jié)果表明：空育131苗瘟0級，葉瘟4級，穗頸瘟3級，綜合抗性評價中抗;對照日本晴苗瘟9級，葉瘟8級，穗頸瘟9級，綜合抗性評價高感（表2）。由此可見，空育131具有較好的抗性。

3 討論與結(jié)論

稻瘟病是水稻重要的病害之一，對糧食高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的手段是利用水稻自身的抗性基因。雖然目前至少在水稻中發(fā)現(xiàn)超過100個稻瘟病抗性位點，其中有27個已經(jīng)被鑒定與克隆，但由于這些抗病基因接近一半成簇分布在第1、6和11染色體，并且這些基因簇內(nèi)的基因高度同源，對稻瘟病菌株的抗譜存在交叉。因此，利用傳統(tǒng)的稻瘟病生理小種很難將它們劃分開來，從而限制了這些抗性基因的應(yīng)用。

Pik基因組區(qū)域存在著多個在序列上高度相似的候選基因，近年來，隨著分子遺傳學(xué)及病理學(xué)的發(fā)展，在該基因座中至少克隆了包括Pik、Pikm、Pikp、Pi1、Piks、Pike 和Pikh等7個基因，且序列高度同源。這些基因?qū)χ袊煌緟^(qū)稻瘟菌生理小種較廣譜和持久的抗性不同，其中Pik、Pikm、Pikp基因?qū)V東、湖南、四川、江蘇等稻瘟菌株的抗性頻率達(dá)到90%以上;Pikm、Pik、Pikp基因?qū)|北地區(qū)稻瘟菌株的抗性頻率低于50%[8]。因此，鑒定并利用該基因座的不同功能基因，可有效提高抗病育種效率。

空育131引自于日本，自1983年以來累計推廣面積超過964萬hm2[12]，在中國的糧食生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用。由于該品種主要在北方粳稻區(qū)推廣應(yīng)用，因此推測其中含有的抗原有可能對南方的稻瘟病菌小種具有一定的抗性。本試驗結(jié)果表明，該品種在福建省國家級稻瘟病重發(fā)多發(fā)鑒定區(qū)上杭縣具有很好的抗性;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，空育131含有抗性基因Pik，因此，它可作為抗原，供南方水稻抗性育種應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]許雨晨，呂哲，陳保善，等.稻瘟病菌Dam1基因的克隆、原核表達(dá)及純化[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016（9）：2385-2389.

[2]DODDS P N，RATHJEN J P.Plant immunity：towards an integrated view of plantpathogen interactions[J].Nature Reviews Genetics，2010，11（8）：539-548.

[3]殷得所，夏明元，李進(jìn)波，等.抗稻瘟病基因Pi9的STS連鎖標(biāo)記開發(fā)及在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用[J].中國水稻科學(xué)，2011（1）：25-30.

[4]ZHAI C，LIN F，DONG Z，et al.The isolation and characterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication[J].New Phytologist，2011， 189（1）：321-334.

[5]HUA L X，WU J Z，CHEN C X，et al.The isolation of Pi1，an allele at the Pik locus which confers broad spectrum resistance to rice blast[J].Tag.theoretical & Applied Genetics，2012，125：1047-1055.

[6]ASHIKAWA I，HAYASHI N，YAMANE H，et al.Two Adjacent NucleotideBinding SiteLeucineRich Repeat Class Genes Are Required to Confer PikmSpecific Rice Blast Resistance[J].Genetics，2008，180（4）：2267-2276.

[7]YUAN B，ZHAI C，WANG W J，et al.The Pikp resistance to Magnaporthe oryzaein in rice is mediated by a pair of closely linked CCNBSLRR genes[J].Theoretical and Applied Genetics，2011，122（5）：1017-1028.

[8]WANG L，XU X，LIN F，et al.Characterization of Rice Blast Resistance Genes in the Pik Cluster and Fine Mapping of the Pikp Locus[J].Phytopathology，2009，99（8）：900-905.

[9]ZHAI C，ZHANG Y，YAO N，et al.Function and Interaction of the Coupled Genes Responsible for Pikh Encoded Rice Blast Resistance[J].PLoS ONE，2014，9（6）：1-11.

[10]PRITCHARD J K，STEPHENS M，DONNELLY P.Inference of population structure using multilocus genotype data[J].Genetics（Print），2000，155（2）：1567-1588.

[11]WARSCHEFSKY E，PENMETSA R V，COOK D R，et al.Back to the wilds：Tapping evolutionary adaptations for resilient crops through systematic hybridization with crop wild relatives[J].American Journal of Botany，2014，101（10）：1791-1800.

[12]國家水稻數(shù)據(jù)中心.空育131（墾鑒30-31）[EB/OL].[2019-06-01].http：//www.ricedata.cn/variety/varis/600008.htm.

（責(zé)任編輯：柯文輝）