培元通腦膠囊對CI大鼠工作記憶及海馬內谷氨酸及其受體表達的影響

白晶　高永紅　高穎

摘要 目的：探討培元通腦膠囊對腦缺血大鼠工作記憶行為及海馬區谷氨酸（Glu）含量、N-甲基-D-天冬氨酸受體2B（NMDA Receptor 2B，NR2B）的影響。方法：將52只雄性SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、尼莫地平組和培元通腦組，每組均13只。模型組、尼莫地平組和培元通腦組均將雙側頸內動脈結扎制備大鼠腦缺血模型。尼莫地平組和培元通腦組每日分別按體質量給予相應的藥物灌胃共治療4周。采用Morris水迷宮實驗觀察大鼠的工作記憶功能;尼氏染色法觀察大鼠海馬組織尼氏體表達情況;高效液相色譜法檢測海馬區Glu含量變化，Westernblot法檢測大鼠海馬區NR2B蛋白表達。結果：Morris水迷宮工作記憶逃避潛伏期假手術組大鼠（第1天與第2天比較、第1天與第3天比較P>0.05，第1天與第4天比較P<0.05）;模型組大鼠（第1天與第2天比較、第1天與第3天比較P>0.05，第1天與第4天比較P<0.05）;尼莫地平組大鼠（第1天與第2天比較、第1天與第3天比較P>0.05，第1天與第4天比較P<0.05）;培元通腦組大鼠（第1天與第2天比較、第1天與第3天比較P<0.05，第1天與第4天比較P<0.01）。海馬內谷氨酸含量假手術組與模型組比較（P<0.05），模型組與培元通腦組比較P<0.05。NMDA2B受體蛋白表達比較假手術組與模型組、尼莫地平組、培元通腦組比較，差異有統計學意義（P<0.01），模型組與尼莫地平組比較（P<0.05）與培元通腦組比較（P<0.01）。結論：培元通腦膠囊能改善腦缺血大鼠的工作記憶能力，保護神經元細胞，其機制可能與上調海馬區Glu、NR2B表達有關。

關鍵詞 培元通腦膠囊;腦缺血;工作記憶;谷氨酸;N-甲基-D-天冬氨酸受體2B

Effects of Peiyuan Tongnao Capsules on Working Memory，Glu in Hippocampus and Expression of Its Receptor in Rats with Cerebral Ischemia

Bai Jing，Gao Yonghong，Gao Ying

（Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Mdedicine，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Peiyuan Tongnao（PYTN）Capsules on working memory，content of Glu in hippocampus and NMDA Receptor 2B（NR2B）in rats with cerebral ischemia（CI）.Methods：A total of 52 male SD rats were randomly divided into sham operation group（n=13），model group（n=13），nimodipine group（n=13）and PTNY group（n=13）.The latter 3 groups were performed with bilateral carotid artery ligation.The nimodipine group and PTNY group were given corresponding drugs daily by gavage for 4 weeks according to body weight.The working memory of the rats was was tested by Morris water maze.The expression of Nissl body in hippocampus was observed by Nissl staining.Determination of Glu in hippocampus was conducted by High Performance Liquid Chromatography.The expression level of NR2B was determined by Western blot.Results：Morris water maze working memory escape latency：the sham operation group（DAY 1 versus DAY 2，DAY 1 versus DAY 3，P>0.05; DAY 1 versus DAY 4，P<0.05）; the model group（DAY 1 versus DAY 2，DAY 1 versus DAY 3，P>0.05，DAY 1 versus DAY 4，P<0.05）; the nimodipine group（DAY 1 versus DAY 2，DAY 1 versus DAY 3，P>0.05，DAY 1 versus DAY 4，P<0.05）; the PYTN group（DAY 1 versus DAY 2，P>0.05，DAY 1 versus DAY 3，DAY 1 versus DAY 4，P<0.05）.The content of Glu in hippocampus：the sham operation group was significantly different from the model group（P<0.05）; the model group was significantly different from the PYTN group（P<0.05）.The expression of NR2B：the sham group was significantly different from the model group，the nimodipine group and the PYTN group（P<0.01）; the model group was significantly different from the nimodipine group（P<0.05）; the model group was significantly different from the PYTN group（P<0.01）.Conclusion：PYTN Capsules were helpful for improving working memory and protecting neurons in rats with cerebral ischemia，whose mechanism may associate with increasing Glu in hippocampus and the expression of NR2B in hippocampus.

Key Words Peiyuan Tongnao Capsules; Cerebral ischemia; Working memory; Glu; NMDA receptor 2B

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.012

腦組織的存活和發揮功能依賴于血液的持續流動，血液為其提供能量、氧氣并帶走代謝廢物[1-2]，頸顱血管是腦組織血液運行的通道，因此，血液本身及頸顱血管病變都可引起腦組織損傷性疾病，頸動脈狹窄可引起部分腦組織供血不足，物質交換受阻引起腦組織萎縮甚至壞死，進而出現認知功能障礙[3-4]，不僅降低患者生命質量，而且顯著縮短卒中患者的生存時間，給家庭及社會帶來了沉重的負擔，已經成為導致年齡相關的認知障礙和癡呆第二常見原因[5]。中醫學認為，氣血不榮，腦髓失充，腦需要氣血津液不斷的充養、滋潤，腦髓失養，則不能發揮統領官骸的功能[6]。腎為封藏之本，藏精主骨生髓，髓通于腦?！澳I充于腦”的觀點認為腎能生髓并生精，腦能統髓，髓上充于腦。腎的精微物質充養于腦，為腦發揮功能的物質基礎，若腎中精氣匱乏，無精充盈，其腦空虛，久之則出現腦老化[7]。

培元通腦膠囊配方秉承道法自然的原理，在多種交互影響的因素和復雜的穩態系統中取類比象，從腎的臟腑理論出發，認為腎中精氣是機體生命活動的根本，對機體各種生理活動均起著極為重要的作用，故治內功能性質的病要先看腎之虛實，扶助腎中正氣，佐以祛瘀熄風通絡之品，可既病減輕損傷，又可預防在先，防止傳變。課題組應用培元通腦膠囊膠囊益腎填精，熄風通絡的藥理作用治療腦缺血大鼠，觀察其對于腦缺血大鼠認知功能的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD大鼠52只，雄性，白色，平均體質量（250±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號[SCXK（京）2012-0006]，飼養于北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物中心屏障實驗室（中醫內科學教育部暨北京市重點實驗室），溫度22～24 ℃，濕度50%～70%。自由進食、進水，12 h明暗交替光照。

1.1.2 藥物 培元通腦膠囊（河南羚銳制藥有限公司，生產批號：1709192），組方：制何首烏429 g、熟地黃286 g、天冬286 g、醋龜甲46 g、鹿茸23 g、酒蓯蓉114 g、肉桂24 g、赤芍49 g、全蝎48 g、燙水蛭96 g、地龍49 g、炒山楂142 g、茯苓48 g、炙甘草29 g，由上述藥物制成干浸膏粉，灌胃時加水配制成溶液。尼莫地平片[拜耳（中國）有限公司，國藥準字H20003010]，使用藥品研磨器磨成粉末配制成溶液。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：NMDA2B受體抗體[艾博抗（上海）貿易有限公司，批號Anti-NMDAR2B抗體（ab65783）];儀器：Agilent-1200高效液相色譜儀，儀器型號：agilent-1200型，制造商USA Agilent Technologies。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用SPSS 24.0統計軟件產生隨機數字，進行隨機分組。將52只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、陽性對照組（尼莫地平組）、培元通腦組，每組13只。模型制備：雙側頸總動脈結扎法，10%水合氯醛（3 mL/kg體質量）腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠固定在白色泡沫墊上，以利于保持大鼠體溫。將麻醉后大鼠仰臥于手術臺上，取頸部正中切口，沿胸鎖乳突肌內側緣分離肌肉及筋膜，找到頸動脈鞘，將右側頸總動脈與迷走神經輕輕剝離后應用6～0號滅菌線束將頸總動脈行兩端結扎并剪斷，左側頸總動脈行同樣手術操作后，縫合頸部切口。模型組、尼莫地平組、培元通腦組均進行相同頸部血管結扎手術，假手術組僅鈍性分離雙側頸總動脈無其他操作即縫合頸部切口。頸部手術結束后各組動物均腹腔注射青霉素注射液1 mL防術后感染。

1.2.2 給藥方法 依據陳奇主編《中藥藥理實驗方法學》[10]按照體表面積換算，大鼠的尼莫地平灌胃劑量為8.1 mg/kg，培元通腦膠囊灌胃劑量為0.486 g/kg。每天上午定時灌胃給藥（假手術模型組給予相應體質量的飲用水灌胃，尼莫地平組及培元通腦組均給予相應劑量的藥物）以外，飼養期間動物自由攝食和飲水。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 行為學測試（Morris水迷宮） 飼養動物至8周時進行Morris水迷宮定位航行訓練[8-9]，2 d后進行工作記憶測試。1）環境適應：訓練開始前24 h，讓大鼠在沒有站臺的水迷宮內游泳3 min以適應環境;2）訓練期：將大鼠背向水池從每個象限的中點放入迷宮中，隨機變換每個試次的入水象限，站臺的位置保持不變（第Ⅲ象限）。大鼠在60 s內找到站臺后在上面停留5 s，如果大鼠在60 s內沒有找到站臺，則將其引導至站臺并停留5 s。大鼠每天接受非站臺象限入水訓練，共2個區塊訓練（每個區塊包括3個試次）。每個試次之間的間隔為60 s，2個block之間的間隔為3 min，共訓練3 d。使大鼠學會尋找站臺的一般規則;3）工作記憶：參考記憶訓練2 d后進行。在參考記憶訓練階段站臺位于東北象限位置，第1天變換站臺位置至西南象限位置，每天更換站臺象限，每天訓練3次，即保證除站臺所在象限以外的象限均入水1次。入水象限更換次序：第1天-西南象限，第2天-西北象限，第3天-東南象限，第4天-東北象限。

1.2.3.2 尼氏染色 每組其中隨機選取5例大鼠取全腦，將海馬部位切片制作蠟塊，進行尼氏染色，觀察海馬CA1、CA3、DG區尼氏小體表達情況。

1.2.3.3 生物檢測 谷氨酸含量測定：海馬樣品稱重、離心10 min，取上清液，應用美國Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent Chem Station工作站），色譜柱：ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×150 mm，5 μm）;檢測波長：激發光波長λex=340 nm，發射光波長λem=450 nm。柱溫40 ℃，進樣量15 μL;Westernblot分析：取大鼠右側海馬組織，樣本蛋白提取：將組織樣品研磨破碎加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑）進行重懸，冰上裂解30 min進行蛋白提取，轉膜方法：PVDF膜轉移至電轉液中，按照電流300 mA恒流轉膜;稀釋，培養，一抗洗膜，二抗孵育：用Western blot封閉液稀釋二抗（NMDA2B受體抗體，Abcam/ab65783），羊抗兔-HRP 1∶5 000稀釋，TBST洗膜，條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進行讀取。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較應用方差分析，組內比較應用T檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。大鼠行為學測試結束后斷頭腦，取左側海馬高效液相色譜法測定谷氨酸含量，右側海馬進行westerblot測定NMDA2B受體測定。

2 結果

2.1 水迷宮第1、2、3、4天逃避潛伏期比較 Morris水迷宮：假手術組大鼠（第1天與第2天比較、第1天與第3天比較P>0.05，第1天與第4天比較P<0.05）;模型組大鼠（第1天與第2天比較、第1天與第3天比較P>0.05，第1天與第4天比較P<0.05）;尼莫地平組大鼠（第1天與第2天比較、第1天與第3天比較P>0.05，第1天與第4天比較P<0.05）;培元通腦組大鼠（第1天與第2天比較、第1天與第3天比較P<0.05，第1天與第4天比較P<0.01）。

各組大鼠在適應訓練后均能完成空間學習記憶任務，但是，模型組大鼠在完成工作記憶任務尋找站臺的潛伏期在第2天和第3天明顯長于培元通腦組大鼠，第4天2組干預組與模型組大鼠尋找站臺的潛伏期差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 尼氏染色結果 在尼氏小體表達方面，模型組圖片中顯示Nissl小體的數量減少甚至消失，細胞皺縮，核固縮，神經細胞排列松散，染色變淺、模糊不清，而尼莫地平組、培元通腦組Nissl小體較多，細胞排列較緊密，染色清楚。

2.3 各組海馬組織內谷氨酸含量比較 假手術組谷氨酸含量測定高于模型組，差異有統計學意義，與尼莫地平組、培元通腦組比較，差異無統計學意義，模型組與尼莫地平組比較，差異無統計學意義（P=0.056>0.05），模型組與培元通腦組比較，差異有統計學意義（P=0.045<0.05），尼莫地平組與培元通腦組比較，差異無統計學意義;各組海馬組織內NMDA2B受體相對灰度值比較：各組海馬組織內NMDA2B受體蛋白表達比較模型組與尼莫地平組比較（P=0.036<0.05），與培元通腦組比較（P=0.005<0.01），尼莫地平組與培元通腦組比較（P=0.404>0.05）。見表2。

3 討論

缺血性腦血管病是世界范圍內致殘致死的主要原因，高危非致殘性缺血性腦血管事件（High Risk Non-disabling Ischemic Cerebrovascular Events，HR-NICE）所致認知障礙癥狀隱匿，不易察覺，影響患者精細工作能力及社會活動，導致患者生命質量下降，已引起醫學界高度重視[11]。我們應用完全永久阻斷頸動脈系統供血的大鼠模型[12-13]，能夠模擬前腦缺血性損傷[14]，手術前后經激光散斑血流成像儀PeriCam PSI觀察，假手術組術前術后腦灌注量無明顯變化，其他3組術后腦血流灌注均有顯著下降。

本研究病機上立論于缺血導致毒損腦絡，治療上以扶正護腦為治療原則，腦的功能主要是靈機記憶、認知思考等高級神經思維活動，這些功能依賴于腦絡的氣血滲灌，王永炎院士等[15-16]提出腦內血絡、氣絡之概念，認為腦氣絡、血絡無法正常推動、調節、統攝血液運行則腦失所養、毒邪內生，而腎為一身陰陽之根本，腎陽不足溫煦蒸騰無力，無以溫脾，脾不健運聚濕生痰濁;腎陰不足無以化生精血，致生化乏源、髓?？仗?、神機失用（《內經精義》《醫林改錯》），培元通腦膠囊全方配伍有益腎填精、息風通絡的作用，該方以制何首烏補肝益腎養血祛風、熟地黃滋陰補血、生精益髓共為君藥，滋養肝腎、填補精血、補益腎元;臣藥龜甲、天冬共助君藥養陰增液、可治液枯內動之虛風平息風陽，鹿茸、酒蓯蓉共壯腎陽，以助君藥陪補下元;佐藥全蝎、地龍、赤芍、水蛭共奏疏通脈絡、祛瘀血作用，為佐助之品，肉桂佐助鹿茸肉蓯蓉溫腎壯陽，同時引火歸元防止虛陽浮越，山楂、茯苓防補藥之滋膩礙胃，影響脾胃;使藥炙甘草調和諸藥[15]。

本研究觀察大鼠在水迷宮中完成工作記憶任務的過程，發現在行為學方面各組大鼠在基礎訓練完成后基本熟悉迷宮環境，但是模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長。本研究發現培元通腦組大鼠較快適應了站臺變化，因此該組大鼠能在第2天試驗時在首次發現站臺之后即可短時存儲站臺位置標記，能夠使用較短的路徑到達平臺、逃避潛伏期縮短，而模型組大鼠則在第4天整體逃避潛伏期才改善，腎為作強之官伎巧出焉，水迷宮工作記憶的改善體現了培元通腦益腎填精的作用。

在尼氏小體表達方面，模型組圖片中明顯顯示Nissl小體的數量減少甚至消失，細胞皺縮，神經細胞排列松散，而假手術組、尼莫地平組、培元通腦組Nissl小體較多，Nissl小體是神經細胞合成蛋白質的場所，經過改善缺血的治療能夠保護Nissl小體，使其發揮功能為神經活動提供必要的蛋白質。

腦的高度復雜性組構是由于存在大量互相交流的細胞，它們可以編碼和在一定的距離內傳導信息，這種信息在神經系統內的運動，而突觸在其中為關鍵結構[16]，在突觸的信息傳遞中不同的神經遞質有著不同的作用，谷氨酸及其受體不論在形態學或功能學的研究都有大量報道[17]，谷氨酸NMDA受體興奮能夠增強突觸傳遞的效能，該現象被稱為長時程增強（Long-term Potentiation，LTP），海馬的興奮性突觸傳遞由谷氨酸受體（NMDA受體）介導[18]，水迷宮發明者Richard Morris等人給大鼠注射NMDA受體阻斷劑，觀察到大鼠不能記住水下平臺的位置，為NMDA受體依賴性過程在記憶中的作用提供證據。功能性NMDA受體需由NR2亞單位與NR1共同形成四聚體，NR2B C-末端多種蛋白激酶磷酸化位點為NR2B的磷酸化和去磷酸化的基礎，而蛋白可逆磷酸化是細胞信號轉到過程的共同機制[19]，因此，本研究選擇進行谷氨酸含量及NMDA receptor 2B（NR2B）為觀察對象。

研究中觀察到各組大鼠海馬內谷氨酸含量比較：假手術組谷氨酸含量測定高于模型組，差異有統計學意義，與尼莫地平組、培元通腦組比較無差異，模型組與尼莫地平組比較，差異無統計學意義，模型組與培元通腦組比較，差異有統計學意義，尼莫地平組與培元通腦組比較，差異無統計學意義;NMDA2B受體蛋白表達比較假手術組與模型組、尼莫地平組、培元通腦組比較，差異有統計學意義，模型組與尼莫地平組比較（P<0.05）與培元通腦組比較（P<0.01），尼莫地平組與培元通腦組比較，差異無統計學意義。谷氨酸作為興奮性神經遞質，在本研究中經過培元通腦膠囊的治療，其在海馬內含量較模型組含量升高，尼莫地平組表現平平，但是與培元通腦組差異無統計學意義，但是NR2B表達觀察組優于模型組，培元通腦組和尼莫地平組之間差異無統計學意義。

因此培元通腦膠囊全方君臣佐使配伍能夠達到改善神經元代謝的功能，息風通絡作用能改善血流，使精微物質上輸于腦，同時改善腦的脈絡使其循環廢物順利排出，藥物的作用機制可能通過上調腦缺血大鼠海馬神經元谷氨酸含量及NR2B蛋白表達，改善缺血大鼠在Morris水迷宮的表現，體現了益腎填精、腎氣充盛進而筋骨強健，動作敏捷，本研究觀察到培元通腦膠囊對腦缺血大鼠工作記憶、神經遞質及受體均有影響。

研究中發現，培元通腦組與尼莫地平組比較，差異無統計學意義，首先我們考慮兩者有比較類似的作用，都能改善微循環，保護神經元;其次，條件限制使得本研究觀察例數有限，觀察周期較短，未能更好更全面的發揮藥物的作用，以上不足將在我們今后的研究中改良。

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（2018-09-10收稿 責任編輯：王明）