HAART治療與心理干預對HIV感染者外周血CD4+T細胞凋亡的影響

柏春琴，姚文虎，朱云鴻

（東南大學附屬南京第二醫院感染科，南京 210003）

HAART治療與心理干預對HIV感染者外周血CD4+T細胞凋亡的影響

柏春琴，姚文虎*，朱云鴻

（東南大學附屬南京第二醫院感染科，南京 210003）

目的 觀察高效抗逆轉錄病毒療法（HAART）與心理干預對HIV感染者外周血CD4+T細胞內Ca2+濃度、細胞凋亡率、細胞線粒體膜電位的改變，探討其對HIV感染者外周血CD4+T細胞凋亡的影響。方法 應用免疫磁珠分離外周血CD4+T細胞，流式細胞術檢測細胞內Ca2+濃度，線粒體膜電位，細胞凋亡率。結果 HAART治療心理干預對HIV感染者外周血CD4+T細胞凋亡百分率明顯低于對照組，降低細胞內Ca2+濃度，提高線粒體膜電位，與對照組相比差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論 HAART治療可抑制HIV感染者外周血CD4+T細胞凋亡的發生，可能與其穩定線粒體膜電位，抑制細胞內鈣超載作用相關。

HIV；CD4+T細胞；HAART治療；心理干預；凋亡

國內外研究發現HIV感染可能增加了CD4+T細胞的凋亡率[1,2]。這種變化提示CD4+T細胞凋亡可能參與HIV感染的致病性和AIDS的發病機制。體外研究發現HIV感染者CD4+T細胞凋亡率較正常對照明顯升高[3]，感染早期血中病毒滴度很高，而后在CTL細胞和抗HIV抗體共同作用下維持在一個穩定的低水平，并在2～10年內保持平衡，HIV蛋白、激活誘導的細胞死亡（AICD）、細胞因子生成紊亂打破了這種平衡，CD4+T細胞進行性凋亡，淋巴細胞破壞增加后，為了維持T細胞的穩態，機體大量初始細胞被激活，一方面可轉化為記憶T細胞，另一方面其大量活化又促進了AICD的產生，最終導致CD4+T細胞被耗竭。可見積極抗病毒治療，阻止免疫細胞的凋亡對AIDS患者免疫重建有重要作用[4]。

HAART抗病毒治療是艾滋病最根本的治療，而HAART是目前艾滋病抗病毒治療的標準療法。HAART的應用顯著降低了艾滋病的發病率和病死率，改變了HIV感染的自然史，使艾滋病從一種致死性的亞急性感染成為一種可以控制的慢性疾病。慢性病毒感染，可以導致淋巴細胞表面PD-L1的表達上調，降低免疫功能，而阻斷PD-L1，可以提高淋巴細胞的抗病毒能力[2]。雖然HAART尚不能將HIV病毒從體內完全清除，但可以盡可能地長期抑制病毒復制，將病毒載量控制在現有方法無法檢測的水平（＜50拷貝/mL），幫助患者重建免疫功能，提高患者生存質量和存活率，延長患者的壽命。有研究對比HAART問世前后艾滋病患者的病死率后發現，HAART使HIV感染者的病死率從1996年至1999年的1.63%下降到了2003年至2005年的1%。如果患者自20歲起開始接受HAART，壽命將從36.1歲延長至49.4歲。HIV感染者經過積極的抗病毒治療，壽命可達正常人的2/3[1]。近年來，佑安醫院的主任醫師張可說：“20歲感染HIV病毒者可活到63歲，40歲感染HIV病毒者可活到73歲。”

心理干預：HIV感染者/AIDS患者是一部分特殊人群，疾病對他們生理造成嚴重影響的同時，其心理問題也日益突出，心理危機出現的概率逐漸升高，而心理干預可以體現人類尊嚴和提高其生存質量[3]。有效的心理護理在輔助治療中占有重要的席位，心理干預措施把病人作為一個整體看待，從生理、心理、社會多方收集資料，作為整體干預的依據，既運用生物醫學的知識和技術，又充分運用心理因素的作用規律和心理治療的技術進行多層次的系統干預，其有效性逐步得到確認[4，5]。目前越來越多的研究和臨床觀察證實：以減少應激為目的的心理干預能不同程度地提高免疫功能的某個方面，尤其是能增加外周循環中自然殺傷細胞活性，增加T細胞對外來物的吞噬作用，減少抑制/毒性T細胞數量，使輔助/誘導T細胞數量增加，淋巴細胞轉化以及細胞因子增加等[6]。

1 資料與方法

1.1 實驗對象

隨機選取未抗逆轉錄病毒治療的CD4+T細胞300～414個/μL的HIV感染者20例。

1.2 分離CD4+T細胞

采集肝素抗凝外周血20 mL，淋巴細胞分離液（上海索萊寶生物科技有限公司產品）分離單個核細胞、用免疫磁珠法（上海源葉生物科技有限公司）分離CD4+T細胞；含10%胎牛血清的1640培養液（Gibco公司產品）培養，處理組加入紅景天苷（終濃度3μmol/L，購自中國藥品生物制品檢定所），對照組加等量生理鹽水。

1.3 凋亡率檢測

Annxin-V分析 使用FITC標記的Annexin-V和PI雙染法檢測細胞凋亡，根據晶美生物工程有限公司提供的說明書進行操作。即取2萬個細胞，經4℃ PBS漂洗兩次，棄上清，加入250 μL AnnexinV-FITC結合液重懸細胞。取100 μL移入流式細胞儀專用試管，加入5 μL AnnexinV-FITC、10 μL碘化丙啶染色液輕輕混勻。室溫（20～25）℃避光孵育15 min。加入400 μLPBS輕輕混勻，用流式細胞儀進行分析。

1.4 胞內游離鈣的測定

Fluo-3AM（碧云天生物生物技術研究所產品）是一種可以穿透細胞膜的熒光染料。Fluo-3AM進入細胞后可以被細胞內的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細胞內。Fluo-3可以和鈣離子結合，結合鈣離子后可以產生較強的熒光，以熒光強度表示鈣離子濃度。收集細胞，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，用新鮮培養基，加入Fluo-3AM（終濃度為5 μmol/L）的培養液重懸細胞，37℃溫育60 min，PBS洗細胞3次，留細胞懸液1 mL，在流式細胞儀上分析。（激發波長為488 nm，發射波長為526 nm和620 nm）。

1.5 線粒體跨膜電位（Δψm）檢測

JC-1（碧云天生物生物技術研究所產品）在線粒體膜電位較高時聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，可以產生綠色熒光。用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。取5萬細胞，重懸于0.5 mL細胞培養液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養箱中37℃孵育20 min。600 g 4℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清，用冰浴的JC-1染色緩沖液洗滌2次，再用0.4 mL JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細胞儀分析。（JC-1單體、聚合物激發波長分別為：510 nm，580 nm發射波長：530 nm，590 nm）。

1.6 統計學分析

實驗結果以SPSS 11.0軟件分析實驗結果。胞內鈣離子濃度比較用方差分析，其余組間用WilcoxonW秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

HIV感染者外周血CD4+T細胞培養24 h后，HAART治療組的細胞凋亡率（8.03±0.65）%顯著低于對照組（11.16±1.24）%，反應線粒體膜電位崩潰的綠色熒光細胞比率（10.25±0.97）%低于對照組（14.62±2.03）%，培養12 h時后HAART治療組反應胞內鈣離子濃度的Fluo-3熒光強度（87.14±23.0）低于對照組（103.57±21.49）。（表1）。

表1 HAART治療與心理干預后細胞凋亡率、線粒體膜電位、胞內鈣濃度改變（）

表1 HAART治療與心理干預后細胞凋亡率、線粒體膜電位、胞內鈣濃度改變（）

注：兩組比較，P＜0.05。

凋亡率（%） JC-1綠色熒光細胞（%） Fluo-3熒光強度對照組 11.16±1.24 14.62±2.03 103.57±21.49處理組 8.03±0.65 10.25±0.97 87.14±23.05

3 討論

HIV感染可通過多種直接或間接的病理機制使CD+4T淋巴細胞數量進行性減少，減少的原因主要包括HIV直接殺傷細胞，HIV誘導CD+4T淋巴細胞凋亡，補體介導的細胞毒效應及抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）。研究表明，HIVgp120等抗原組份可與CD4受體結合，激活鈣通道，使胞內Ca離子濃度增高，從而影響胞內正常信號傳導，導致CD4+T細胞凋亡[6]。有學者認為這是HIV感染導致CD+4T淋巴細胞數目減少的主要原因[7,8]本次研究發現HAART治療與心理干預HIV感染者外周血CD4+T細胞共培養24 h后胞內鈣濃度較對照低，同時凋亡率下降。對于淋巴細胞而言，Ca2+不僅可以參與細胞凋亡的調節，其濃度升高還是淋巴細胞激活和增殖早期呈現的一個重要現象。推測HAART治療有提高介導細胞發生凋亡的細胞內Ca2+濃度的閾值的作用，從而淋巴細胞進入活化增殖階段，導致凋亡的淋巴細胞所占的比例下降[9]。

線粒體是細胞能量代謝的中心，細胞凋亡過程中含BH3結構域的Bcl22家族成員Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa等在接受到胞內的死亡信號后激活。這些含BH3結構域的Bcl-2家族成員與另（Bax亞家族成員Bax，Bak等，主要松散的結合在線粒體外膜面或存在于胞漿）作用，導致后者的寡聚并插入線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，跨膜電位丟失，釋放細胞色素C（Cytc）和其他蛋白[10]，而Cytc的釋放是線粒體凋亡路徑的主要步驟。Jacotot[11]等證明，HIVvpr蛋白主要通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。本實驗中發現HAART治療與心理干預抑制了線粒體膜電位的崩潰，減少凋亡發生率。

綜上所述HAART治療與心理干預能抑制HIV感染者外周血CD4+T細胞的凋亡發生率，可能通過抑制鈣內流和線粒體膜電位崩潰實現[12]。

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HAART treatment for HIV infections with psychological intervention CD4+T peripheral blood cell apoptosis infl uence

BAI Chun-qin,YAO Wen-hu,ZHU Yun-hong
(Southeast university hospital affi liated nanjing second,Nanjing 210003,China)

HIV;CD4+T cells;HAART treatment;Psychological intervention;apoptosis

R373.3

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.006.017.03

2010－12－20

柏春琴（1968－），女，江蘇人，本科在讀，主管護師，主要從事臨床護理工作。

〔作者簡介〕*姚文虎，主任醫師，教授。

馬宏宇）