替考拉寧產生菌的誘變選育

王鳳亞

摘要：目的：本文對替考拉寧產生菌進行了誘變選育，以期獲得替考拉寧高產菌株。方法：通過在固體培養基中添加不同濃度替考拉寧篩選耐自身抗性菌株，再結合紫外誘變加氯化鋰的方法，篩選出高產替考拉寧菌株。結論：在研究過程中通過耐自身抗性結合誘變選育，篩選出了替考拉寧高產菌，使發酵單位提高48.5%。

關鍵詞：替考拉寧產生菌;抗性選育;紫外誘變加氯化鋰

替考拉寧，別稱肽可霉素，是一種糖肽類抗生素，主要由游動放線菌產生。替考拉寧可以應用在多重耐藥菌感染治療方面。通過相關研究表明，替考拉寧不僅可以消滅革蘭氏陽性菌，而且對多重耐藥的腸球菌、金黃色葡萄球菌具有明顯的抗菌活性。在治療金黃色葡萄球菌時，普遍應用萬古霉素;但隨著替考拉寧作用的不斷挖掘，替考拉寧在金黃色葡萄球菌的治療方面得到了廣泛應用。現階段金黃色葡萄球菌問題日益突出，替考拉寧、萬古霉素的需求量日益增加。與替考拉寧相比，萬古霉素的毒副作用相對較高，在體內的半衰期較短，因此替考拉寧在治療金黃色葡萄球菌方面更具優勢。為了將替考拉寧的作用充分發揮，需要提高替考拉寧的產量，因此相關學者在替考拉寧產量方面進行了大量研究。本項研究通過添加不同濃度替考拉寧篩選耐自身抗性菌株，再結合紫外誘變加氯化鋰的方法，篩選出高產替考拉寧菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

替考游動放線菌T16-4-18，該菌株由華北制藥華勝有限公司研發試驗室編號并保藏。

1.1.2培養基組分

（1）固體培養基及斜面培養基：FeSO4·7H2O0.04g/L、葡萄糖1.0g/L、酵母粉2.0g/L、MgSO4·7H2O0.6g/L、KCI6.0g/L、K2HPO41.0g/L、PH7.0～7.2。

（2）種子培養基：蛋白胨2.0g/L、糊精4.0g/L、可溶性淀粉24g/L、CaCO32.0g/L、酵母粉6.0g/L、PH7.0～7.2。

（3）發酵培養基：玉米漿16g/L、糊精12g/L、可溶性淀粉20g/L、CaCO32.0g/L、黃豆粉24g/L、PH6.8～7.0。

1.1.3試劑

替考拉寧（本公司自制粗粉），氯化鋰購自天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1替考拉寧在自身抑制方面的情況

1.2.1.1將替考拉寧配置成不同濃度的溶液，經過濾除菌，將其涂布在固體平板培養基上。在含有不同濃度的替考拉寧產品的平板培養基上涂布未經處理的替考拉寧孢子懸液，28℃培養;培養過程中對孢子的生長情況進行密切觀察。

1.2.2抗性菌株的選育

無菌落生長的平板所含替考拉寧濃度即為最小抑菌濃度，在含有最小抑菌濃度替考拉寧的平板培養基上涂布菌株T16-4-18孢子懸液，篩選出存在抗性突變的菌株。

1.2.3紫外誘變結合氯化鋰進行誘變選育

1.2.3.1將氯化鋰加入到滅菌后的固體培養基中，搖勻倒碟子，保證每個平板含有0.5%氯化鋰。

1.2.3.2取新鮮斜面1支，加入無菌純化水后刮下，用玻璃珠打碎10min，制備成孢子液。將孢子液UV照射100s，將照射后的孢子液稀釋到-2、-3、-4，在紅光下分別涂布到含有0.5%氯化鋰的平板上;未經照射的孢子液（自然分離）稀釋到-4、-5、-6進行涂布。

1.2.3.3平板培養成熟后，挑選一定數量單菌落接種斜面，培養后接種搖瓶和發酵瓶，測定發酵瓶效價。

2結果與分析

2.1替考拉寧在自身抑制方面的情況

研究人員配置相應濃度的替考拉寧成品溶液，使用相應的方法進行過濾除菌，研究人員將處理過后的替考拉寧成品溶液與未經處理的替考拉寧成品溶液分別涂布在不同的平皿上，并對菌落的生長情況進行觀察。研究人員發現，隨著替考拉寧濃度的不斷增加，孢子生長的時間逐漸延長，并且生長速度逐漸放緩，當涂布有0.012g替考拉寧時，孢子幾乎不會生長。

研究人員為了更好的分析在替考拉寧產生菌的發酵過程中，是否自身代謝產物會對發酵過程產生抑制，在接種時將0-30mg/L的替考拉寧成品加入到發酵液當中，在發酵培養8天之后，對其效價進行測定。當替考拉寧的添加濃度控制在5mg/L至15mg/L之間時，替考拉寧的效價呈現增長的狀態，但是增長相對緩慢;如果添加濃度為20mg/L，替考拉寧的效價會逐漸下降;如果添加濃度在30mg/L，替考拉寧的效價會受到嚴重的影響。

2.2抗性菌株的選育

菌懸液經紫外線照射600s，暗培養2小時，將其在含有0.012g替考拉寧的平板上進行涂布，28℃培養。挑選出相應數量的菌落接種斜面，對其發酵水平進行對比分析。通過篩選獲得了具有較高生產能力的菌株，編號T-18-043，其發酵效價比出發菌株提高21.2%。

2.3紫外誘變結合氯化鋰進行誘變選育

將通過抗性選育出的菌株TC-18-043制備成孢子液，UV照射100s后涂布在含有0.5%氯化鋰的平板上，28℃培養。平板培養成熟后挑選出相應數量的菌落接種斜面，并進行發酵效價測定。UV結合氯化鋰復合誘變致死率為90%，通過復合誘變選育出高產菌株TC-18-192，發酵效價比出發菌株提高22.5%，比原始菌株提高48.5%。

3討論

對于抗生素產生菌而言，其對自身所產抗生素的耐受能力有所不同，低產菌株的耐受能力相對較差，高產菌株的耐受能力相對較好。本項研究對替考拉寧產生菌的抗性進行篩選，在篩選的過程中利用紫外誘變，從而篩選出了高產菌株T-18-043，使替考拉寧效價提高21.2%。將選育出的高產菌株T-18-043再進行紫外誘變，涂布在含有氯化鋰的平板上，篩選出高產菌株TC-18-192，發酵效價比出發菌株提高22.5%。綜上，通過對原始菌株T16-4-18進行抗性篩選后，再進行紫外誘變結合氯化鋰的方法進行選育，得到高產菌株比原始菌株效價提高48.5%。

徐波等研究人員利用其它技術篩選出了可以將替考拉寧產量提高65%以上的融合菌株。在以后的工作中會繼續對菌種進行篩選，并不斷嘗試新型的選育方法，通過這樣的方式將替考拉寧的耐受性逐步提高。希望通過本項研究，可以為相關人員的后續研究提供借鑒。

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（作者單位：華北制藥華勝有限公司）